可以通過加大換水量、降低放養密度、增強底部排污、控制飼料投喂量等方式來防控EHP

• 文/圖 中國水產頻道 唐東東

  
  

　　中國水產頻道原創獨家報道，低養成率使得南美白對蝦養殖在中國遭受挑戰，盡管成功養殖是一個系統的工程，但業者仍期待有更為優良或更適應中國養殖環境的蝦苗出現，以致近幾年全球的種蝦公司紛紛前往中國這一世界最大的對蝦養殖市場淘金。

　　粗略統計，在2016年時就有13家境外的種蝦公司進入中國市場。當然，期間不乏企業因蝦苗在養殖過程中表現不突出而黯然離場，但淘金者向來并不缺少，仍有種蝦公司在不斷涌入，泰國頂豐水產養殖有限公司（簡稱“泰國頂豐”，英文名：TOP AQUA TECHNOLOGY）便是去年的新進者。

　　事實表明，對于中國的蝦苗繁育場來說，選擇新的種蝦來源無疑是在懸崖邊跳舞，有可能收獲掌聲，也可能是一次致命的打擊。因此，作為新的種蝦品牌要想切入中國市場，被正確了解和評估是前提。為了將種蝦的情況展示給中國對蝦養殖業者，筆者受泰國頂豐邀請于6月11日起對其進行為期四天的跟進了解。

與Timothy William Flegel教授、 Onchuma Itsathiphaisarn 博士交流現場

　　第一站：泰國國立瑪希隆大學Centex Shrimp （泰國國家認證第三方機構）

　　除了水環境的不斷惡化之外，逐年增加的病害也是南美白對蝦低養成率的主要影響因素，其中未經嚴格檢測的非正關渠道進入的種蝦，曾被認為是導致國內對蝦養殖新型病害頻發的重要原因之一。因此，嚴格且精準的檢測是保證SPF種蝦質量的關鍵環節。據介紹，泰國頂豐一直選擇在Centex Shrimp (泰國瑪希隆大學對蝦分子生物和生物技術實驗室)進行譬如EHP、WSSV、EMS、IHHNV、IMNV、ATM等多種對蝦特定病原體檢測。

　　Centex Shrimp組建于2001年10月，是由瑪希隆大學和泰國國家遺傳工程與生物技術研究中心（BIOTEC）共同成立的一個多學科實驗室，屬于泰國官方在對蝦領域的權威檢測及研究機構，多年來接收全球各地研究機構人員前來交流學習PCR技術。目前有Timothy William Flegel、Kallaya Sritunyalucksana以及Suparat Taengchaiyaphum等3位教授主管項目，主要的研究工作包括：蝦類病原體（病毒、細菌和寄生蟲）的分子研究、開發用于蝦病的診斷探針和試劑盒、研究蝦的體液和細胞防御機制、蝦基因組分析、蝦的營養研究，尤其是提高繁殖能力方面、開發和改良SPF黑虎蝦。

　　Timothy William Flegel教授是Centex Shrimp病原體發現和鑒定平臺的負責人，也是全球知名的蝦類病害研究專家，曾與臺灣羅竹芳教授合作研究并公開確定引起對蝦急性肝胰腺壞死病（AHPND）的那株特異性副溶血性弧菌的PCR快速檢測方法，并公布了檢測方法的PCR引物及反應方法。2016年，其參與研究了目前全球靈敏度最高的關于EHP（蝦肝腸胞蟲）的新型PCR檢測方法，能最大程度減少假陽性現象的出現，避免出現誤檢。

Timothy William Flegel教授和泰國頂豐人員合影

　　EHP于2009 年在泰國生長緩慢的斑節對蝦中由Centex Shrimp首次發現分離而命名，實際上自2003年起，泰國斑節對蝦的養殖一直受生長緩慢綜合征（MSGS）的影響，但一直沒有確定病因。2013年，EHP首次在中國被發現，并迅速蔓延成為對蝦養殖的主要病害。據了解，EHP侵染對蝦肝胰腺部位，但感染后無明顯臨床癥狀，往往在養殖30-45天以上才發現生長緩慢、不長個的現象，極易造成飼料損耗，嚴重影響生產甚至導致虧本。由于早期難以發現，只能依靠PCR分子生物學的方法，去檢測對蝦組織（主要存在于肝胰腺組織中）、排泄物（糞便）和水體中是否存在EHP來進行預防。

Centex Shrimp工作人員正在提取EHP的DNA（圖片來源于Centex Shrimp）

同批次養殖中出現規格差異明顯的對蝦，抽樣來檢測對蝦肝胰腺中是否存在EHP（圖片來源于Centex Shrimp，下同）

　　過去，PCR檢測方法是針對EHP核糖體小亞基RNA（SSUrRNA）基因的SSU-PCR方法，但Timothy William Flegel教授所在的研究團隊發現，SSU-PCR的引物會與其它的微孢子蟲DNA發生交叉反應，導致產生假陽性的檢測結果。也就是說，苗場或種蝦場可能會因為誤診而不得不把蝦苗、種蝦直接處理掉，導致遭受不必要的損失。因此，對EHP進行精確診斷顯得非常重要。

　　為了克服這個問題，從2011年開始歷時五年時間，在2016年一個敏感且特異性強的PCR方法被開發出來。“我們應用巢式PCR避免了假陽性EHP現象的出現，而且針對特定的孢壁蛋白SWP基因進行的新SWP-PCR（Spore wall protein primer，也稱SPW-PCR）方法靈敏度更高。”Timothy William Flegel教授表示。相關對比實驗數據顯示，從感染了EHP的對蝦肝臟中提取了25份DNA樣品，利用普通PCR做SSU-PCR檢測只顯示12%的樣本呈陽性結果，而用SWP-PCR后顯示88%的樣品呈陽性。同時，采用普通PCR做SWP-PCR檢測時在特定質粒濃度達到104時能檢測出來，而SSU-PCR方式需要濃度達到106才可以，意味著前者的靈敏度提高了100倍，但是如果采用巢式PCR，兩種檢測方式都可以在10個拷貝濃度下就能確定。所以，普通PCR時選擇做SWP-PCR檢測具有更高的特異性和靈敏度，Timothy William Flegel教授建議可以用其來檢測對蝦類糞便、餌料及所在水環境中的EHP，而不需要殺死對蝦來獲取肝胰腺達到確診的目的。但泰國頂豐聲稱還是選擇用立體隨機取樣的種蝦的肝胰腺來診斷是否感染EHP，以求達到最為準確的結果。

　　此外，Timothy William Flegel教授判斷，由于使用SWP-PCR和SSU-PCR檢測肝胰腺微孢子蟲病（HPM）時顯示相同的結果，因此表明只有一種微孢子蟲能導致對蝦出現HPM。

SPW-PCR （左）與 SSU-PCR （右） 相比，在105濃度下SPW-PCR更靈敏

巢式PCR(下面)與普通PCR（上面）相比，在檢測中需要的DNA數量少

SPW-PCR檢測孢子蟲的結果

檢測蝦肝胰腺中的孢子蟲，放大40倍（A）時看不太明顯，將A框區域放大100倍（B）時看得更清楚

EHP卵使用2% 的Phloxine B然后10分鐘，卵會染上紫紅色

　　Timothy William Flegel教授還認為，即使檢測出EHP的存在，也不代表一定要把蝦苗排掉，而是可以通過加大換水量、降低放養密度、增強底部排污、控制飼料投喂量等方式來進行控制。據悉，目前泰國通過這些處理方式已經無懼EHP。同時，Timothy William Flegel教授透露，現在正與企業合作研究確定EHP在某個濃度時，是該選擇排塘還是能繼續養下去。不過，還沒有具體結論出來。

　　另外，Centex Shrimp還在研發檢測中國對蝦養殖中最新出現的蝦血細胞虹彩病毒（SHIV）的引物。