中國水產(chǎn)頻道獨家報道， 近兩年，蛭弧菌產(chǎn)品的使用又突然火了起來，市面上也出現(xiàn)了各式各樣的蛭弧菌產(chǎn)品，有液體蛭弧菌，有粉劑蛭弧菌，還有蛭弧菌凍干粉，尤其是蛭弧菌凍干粉成了推廣的新潮流，但是同樣都是蛭弧菌凍干粉，有的產(chǎn)品用的很好，有的產(chǎn)品用的卻見不到效果，很多養(yǎng)殖戶甚至廠家都對蛭弧菌相關(guān)產(chǎn)品抱有疑問，本文則希望通過對蛭弧菌知識的初步梳理，為養(yǎng)殖戶、經(jīng)銷商、公司更好的理解、使用蛭弧菌產(chǎn)品提供一些思路。 文/圖 南京新的生物制品有限公司 趙海永 一、到底什么是蛭弧菌？ （一）蛭弧菌基本資料 1、發(fā)現(xiàn)及命名 蛭弧菌是在1962年由Stolp和Petzold首次發(fā)現(xiàn)于菜豆葉燒病假單胞菌體中，隨后從土壤、污水中都分離到了這種細菌。所以蛭弧菌從發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在才不過56年的時間。 蛭弧菌命名為Bdellovibrio bacteriovorus。其中，Bdello一詞來自希臘字，是“水蛭”的意思，“vibrio”意為“弧菌”，而種名“bacteriovorus”是“食細菌”的意思。其命名很有意思，“水蛭”代表了其生理上的一些動作形為，蛭弧菌的捕食生活方式很特殊，它是寄生于其他細菌并能導(dǎo)致其裂解的一類細菌——請注意，是“裂解”，不是整個吃掉哦。 2、什么是蛭弧菌 蛭弧菌也叫噬菌蛭弧菌，屬于細菌界變形細菌門蛭弧菌科蛭弧菌屬，具有細菌的一切形態(tài)特征： 單細胞，弧形或逗點狀，有時呈螺旋狀。0.3-0.6×0.8-1.2微米，或僅為桿菌長度的1/3-1/4，端生鞭毛，比其他細菌的鞭毛粗3-4倍，與鞭毛相對的一端有釘狀纖毛，被稱為“感染錐子”，與菌體的識別和吸附宿主有關(guān)。其運動活躍。革蘭氏染色陰性。  有幾點要特別說明下 第一、蛭弧菌比通常的細菌要小，能通過細菌濾器，所以普通的顯微鏡是看不到它的，至少要用到油鏡，甚至需要染色才行。 第二、在相差顯微鏡下，可見蛭弧菌呈跳躍式的運動。電鏡觀察，蛭弧菌以弧、桿狀為主。 第三、就是因為小，所以，低于2萬轉(zhuǎn)的離心機對蛭弧菌的濃縮都是沒有意義的，而2萬轉(zhuǎn)的離心機則一般是實驗室才會配備，而且容易小，對實際生產(chǎn)而言，應(yīng)用還有些距離。 3、生活方式及生長要求 蛭弧菌有寄生型，也有兼性寄生，極少數(shù)營腐生。非寄生型營腐生生活，可在蛋白胨和酵母提取物培養(yǎng)基上生長繁殖。從自然界分離得到的蛭弧菌都是依賴寄生型，迄今為止，還沒有直接從自然界分離得到非寄生型。不依賴宿主的蛭弧菌，只能生活在實驗室條件下。 寄生型蛭弧菌生長，一般要求pH6.0-8.5；溫度23-37℃，低于12℃，高于42℃時均不生長；能穩(wěn)定分解蛋白質(zhì)，一般不利用碳水化合物，而以肽、氨基酸作碳源和能源；能液化明膠；嚴格好氧。 ——所以請注意以下幾點： 第一、溫度不在適宜范圍的時候，蛭弧菌是不生長的，所以使用時要充分考慮這一點。比如3、4月份用它用泡苗，效果肯定不會好，但如果改成拌料投喂，會對腸道控菌產(chǎn)生積極影響。 第二、蛭弧菌的繁殖是需要氧氣的，使用的時候也建議在早上8-10點使用，這樣可以獲得較為充足的溶氧。另外，其耗氧不會達到非常劇烈的程度，因為其繁殖代時一般要4-6小時。 4、寄生的特異性問題 蛭弧菌與宿主細胞之間，常表現(xiàn)出一定的特異性。不過，有的特異性較差，能侵入多種細菌。例如不同的蛭弧菌菌株，能侵入各類不同的植物病原菌。 從這一點上看，其比噬菌體（病毒）、細菌素（蛋白質(zhì)）的廣譜性要好。實際上蛭弧菌可感染許多不同科屬的菌，但其總體上有一定偏向性，比如其可感染大多數(shù)革蘭氏陰性細菌（如志賀氏菌屬、沙門氏菌屬、埃希氏菌屬、歐文氏菌屬、變形桿菌屬、弧菌屬、假單胞菌屬、鉤端螺旋體等微生物），但只對少數(shù)的革蘭氏陽性（如糞鏈球菌、乳酸菌等）細菌感興趣，比如其就不裂解枯草桿菌，同時也有報道指出其對某些真菌和腸道病毒也有一定的裂解活性。 ——寄生的特異性也對我們的實際使用方法有很大的影響，即蛭弧菌是不是不管好菌壞菌都會攻擊？如果是這樣的話，那么很難被我們所用了，但實際上，其有一定傾向性，這就給我們實際的應(yīng)用提供了更多的可能性。 郭衍彪（2016年）的研究指出，蛭弧菌BDW03對試驗組大菱鲆腸道沒有控制作用的菌屬為8個（占53.3%），這8個菌屬中多為革蘭氏陽性菌屬（6/8）。另外，其通過乳酸菌拌食餌料和潑灑BALOs喂食大菱鲆60d后，乳酸菌和BALOs對大菱鲆腸道菌群中革蘭氏陰性菌的控制作用（分別占總菌屬的33.3%和26.7%）優(yōu)于對革蘭氏陽性菌的控制作用（分別占總菌屬的（26.7%和20.0%）。這也間接指出了蛭弧菌對細菌的裂解可能有一定的偏向性。 徐琴等人（2009）的研究指出，加噬菌蛭弧菌和黏紅酵母組的試驗效果不理想 ,表明這兩株菌體之間有一定的拮抗作用。而聯(lián)合使用噬菌蛭弧菌和球形紅假單胞菌（是紫色非硫光合細菌紅假單胞菌屬的一個種）組展示了凈化水質(zhì),預(yù)防病害的優(yōu)良前景,此組能有效地吸收氨氮、硫化物等有害物質(zhì)。這也指出了蛭弧菌是直接可以和某些光合細菌直接混合使用的，這一點大大提高了使用的方便性。 另外，陳家長等人（2003年）曾在螃蟹養(yǎng)殖中，間隔使用光合細菌和蛭弧菌：每20 天用噬菌蛭弧菌和光合細菌各1次 ,使用方法為使用光合細菌 1 周后使用噬菌蛭弧菌, 實驗周期 3 個月。其中蛭弧菌濃度為107cfu/mL，光合細菌為109cfu/mL。這樣間隔使用的效果也非常不錯，25d 后養(yǎng)殖中華絨螯蟹驗組比對照組池塘中的細菌總數(shù)少2個數(shù)量級, 70d 后實驗組比對照組池塘中的細菌總數(shù)少3個數(shù)量級，另外試驗池塘的COD 、氨氮及硫化物有明顯的降低，有效的提高了中華絨螯蟹的成活率，但是本文并沒有探討如何混合使用。 再加上其他專家的一些總結(jié)，基本上，蛭弧菌更偏向于革蘭氏陰性桿菌，同時從即有的論文得知，其最好不要用酵母混用，但蛭弧菌可以和光合細菌混用，當然，建議最好分開使用。同時還有一個關(guān)鍵點，即在一個20天的周期內(nèi)，蛭弧菌對水體的調(diào)控作用能達到近2周時間。 5、蛭弧菌為什么用雙層平板而不用單層平板法檢測？ 主要的原因在于培養(yǎng)皿底部并不是十分平整，因此注入少量培養(yǎng)基鋪平底部作為下層，會獲得幾近水平的底部，然后在上面將噬菌體和細菌混合物的培養(yǎng)基（比較薄）注入作為上層，這樣使得觀察物在同一平面，更利于噬菌斑的觀察及分離純化。 實際上單層平板法與雙層平板法所形成的噬菌斑的比較圖如下：
6、安全性問題 王亞麗（2007年）的研究指出，將分蛭弧菌離株BD5W以107pfu/mL濃度給小鼠灌胃，試驗組和對照組均健康，證明噬菌蛭弧菌對小鼠沒有毒性作用。 林茂等（2010年）的研究也證實了蛭弧菌作為一種微生態(tài)制劑的無毒無害特點。 徐懿（2011年）在噬菌蛭弧菌BD57的急性毒性試驗研究指出，根據(jù)《獸藥試驗技術(shù)規(guī)范匯編》的要求選用小白鼠進行了急性毒性試驗。分別采用灌胃和腹腔注射法進行了急性毒性試驗，試驗結(jié)果表明，噬菌蛭弧菌 BD57 對小鼠沒有毒性作用。 陳麗蕓（2012年）的研究也指出，至今沒有發(fā)現(xiàn)蛭弧菌對真核細胞有毒的報道，對小白鼠、豚鼠、家兔等動物無毒性作用，對猴腎、Hela細胞組織培養(yǎng)也未引起細胞病變。迄今為止，相關(guān)報道表明蛭弧菌對人和某些動物無毒害作用。 二、蛭弧菌的裂解機制 蛭弧菌對于宿主菌的裂解過程一般分為五個步驟：識別、吸附與侵入、定位與合成、復(fù)制、裂解。整體示意如下圖：  1、識別 在這個過程中，有趣的是蛭弧菌可以通過鞭毛實現(xiàn)跳躍式的運動，而向宿主菌快速移動，其是通過無鞭毛一端粘附于宿主菌表面的。鞭毛在這里起到了非常重要的作用，實際上，在一些發(fā)酵的試驗研究過程中也發(fā)現(xiàn)，如果發(fā)酵罐內(nèi)的漿葉轉(zhuǎn)速過快，對鞭毛有損傷的話，蛭弧菌就無法再攻擊宿主。 2、吸附與侵入 為了實現(xiàn)吸附與侵入這個目的，蛭弧菌菌體會以100轉(zhuǎn)/秒以上的速度產(chǎn)生一種機械“鉆孔”效應(yīng)，加上蛭弧菌入侵時的收縮從而進入宿主菌的周質(zhì)空間 3、定位與合成 一是蛭弧菌會脫掉鞭毛，二是宿主菌會變成蛭質(zhì)體。 4、復(fù)制 蛭弧菌在這個階段實現(xiàn)了復(fù)制繁殖。 5、裂解 在最后一個過程中，蛭弧菌會合成鞭毛，裂解宿主的細胞膜，釋放出所有蛭弧菌。 電鏡的一些圖片如下：  三、蛭弧菌的保存方式研究 黃文等人（2002年）曾對五種蛭弧菌的保存方法做了對比研究，其指出5種保藏方法中以冷凍干燥法保藏效果最好，1個月的復(fù)活率為100%，其次為4℃營養(yǎng)肉湯液保藏法和-20℃甘油保藏法，17個月復(fù)活率均為67%。 當然，有一點要明確，其冷凍干燥完成之后，是在4℃環(huán)境中進行保存的。 另外，鄧璐等人（2008年）研究了不同的保護液、保藏溫度和保藏載體的選擇對蛭弧菌長期保藏的影響,以及對優(yōu)化保藏條件下的蛭弧菌復(fù)蘇率和復(fù)蘇蛭弧菌的噬菌能力檢測,并且對保藏期限內(nèi)宿主菌的存活情況與蛭弧菌的存活情況的相互影響做了首次的報道。結(jié)果表明:以1/100NB等低營養(yǎng)液體為保護液、瓊脂為載體、加入適量宿主菌于4℃,蛭弧菌保存可達2年以上,保存期內(nèi)蛭弧菌的復(fù)蘇率和出斑數(shù)目較對照組都有極其顯著的提高(P<0.01)。 目前常溫保存的研究還未查到，所以建議蛭弧菌產(chǎn)品最好存放于4℃環(huán)境中，實際上普通的立式冷藏冰柜就可以滿足這個條件。 四、蛭弧菌的使用方法 蛭弧菌到底在實際中應(yīng)該如何使用？這必需要結(jié)合蛭弧菌本身的特點，同時考慮現(xiàn)實問題，才能真正發(fā)揮最大效果。實際的用法建議如下： 一、特別推薦在所有甲殼類養(yǎng)殖動物（小龍蝦、螃蟹、白蝦等）脫殼期之前使用，達到無刺激生物消毒這個效果。 1、則脫殼期是這些養(yǎng)殖動物特別脆弱的時期，容易感染相關(guān)疾病，尤其是溫度升高的時候更是如此；另外，在脫殼期，甲殼類動物特別敏感，很多消毒劑是不能使用的，而蛭弧菌則可以做到安全無刺激；使用上，建議提前2天左右使用，如果能先使用一些補鈣產(chǎn)品之后再使用蛭弧菌那就更好了，因為一定量的鈣離子可以促進蛭弧菌的繁殖。 2、推廣“配合化學(xué)消毒劑治療疑難雜癥”。 到了養(yǎng)殖中后期，在溫度高的時候，有些疾病非常難以治療，主要的特點是止不住、易反復(fù)，這個原因主要在于化學(xué)消毒劑雖然具備了快速殺菌的效果，但其反彈也非常迅速，一般普通的化學(xué)消毒劑或者國標抗生素，使用后24-48小時，水體的總菌數(shù)甚至弧菌數(shù)可能比用前還要高，這可能是難以治療的主要原因。 為了讓殺菌即迅速又持久，則必需結(jié)合使用化學(xué)消毒劑和蛭弧菌。首先使用化學(xué)消毒劑對水底、水面進行綜合消毒，同時內(nèi)服國標抗生素進行體內(nèi)消毒，在見到效果之后，再連續(xù)使用1-2次蛭弧菌，就可以看到明顯不同的治療效果。因為化學(xué)消毒劑起到了快速壓制的效果，而蛭弧菌則起到了長期壓制有害菌的效果，強強聯(lián)合，能有效的抑制有害菌的繁殖。 3、建議預(yù)防使用，降低發(fā)病率 在使用過硫酸氫鉀底改片后，第二天可以大劑量使用有益菌，此時建議使用蛭弧菌和光合細菌一起混合使用，這一點已通過試驗證明是可行的。 當然也可以按20天一個周期，先行使用光合細菌，一周后再使用蛭弧菌原裝凍干粉，也能達到比較好的使用效果。 何義進等人（1996年）所做的室外小水體試驗結(jié)果表明，在使用蛭弧菌的水體中，除 DO、p H 比較穩(wěn)定外，其它水質(zhì)理化指標 NH4+-N、NO2--N、總磷和透明度都或多或少地發(fā)生了一些變化。 4、建議拌料防治腸炎 本品最早是做為獸藥在畜禽上推廣使用的，在畜禽上大部分是做為治療腸炎存在，尤其是針對剛出生的小豬小雞。 那么，在水產(chǎn)上如何推廣呢？蛭弧菌其實主要針對大腸桿菌引起的相關(guān)腸炎疾病，因為在發(fā)酵蛭弧菌之前，必需先行生產(chǎn)大腸桿菌，再將蛭弧菌接種進去，大腸桿菌是蛭弧菌最為喜愛的細菌之一，因此其治療此類腸炎效果會更好一些。 另外，蛭弧菌本身就是一個寶庫，其的蛋白質(zhì)含量豐富,可達細胞干重的60%~65%，DNA的含量為5%。 五、南京新的生物制品有限公司簡介 南京新的生物制品有限公司成立至今已有11年的歷史，企業(yè)創(chuàng)始人徐總是國內(nèi)最早一批接觸水產(chǎn)用蛭弧菌的業(yè)內(nèi)人員，在發(fā)展過程中，公司不斷的持續(xù)研發(fā)改進，穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量，一直采用發(fā)酵罐生產(chǎn)蛭弧菌，同時為了更好的服務(wù)客戶，公司在2018年10月份投入近百萬配套了大型凍干機（單次可凍干1萬瓶）。
國內(nèi)發(fā)酵蛭弧菌的公司本身就不是很多，同時擁有大型凍干機的公司更是少之又少，新的經(jīng)過多年的摸索，完成了蛭弧菌制種、發(fā)酵及凍干的全生產(chǎn)過程，能為客戶提供真正的蛭弧菌“原裝凍干”產(chǎn)品，同時做到質(zhì)量可靠、效果穩(wěn)定，同時竭誠歡迎新老客戶垂詢和參觀指導(dǎo)。 |
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