南美白對(duì)蝦“早期死亡綜合癥”的發(fā)病特點(diǎn)及防控
　　
　　蘇樹葉 賴秋明 陳金玲 柯楊勇
　　
　　海南大學(xué)，海南海口，570228

　　
　　中國(guó)水產(chǎn)頻道獨(dú)家報(bào)道，自2009年以來(lái)，南美白對(duì)蝦“早期死亡綜合癥”（EarlyMortalitySyndrome）在亞洲地區(qū)爆發(fā)并蔓延，給亞洲各國(guó)的對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。最近也有學(xué)者將該病稱為“急性肝胰臟壞死綜合癥”（AcuteHepatopancreasNecrosisSyndrome）。有關(guān)南美白對(duì)蝦“早期死亡綜合癥”的研究已有報(bào)道，如FlegelT.W.、LightnerD.、EduardoM.Leano等曾報(bào)道南美白對(duì)蝦“早期死亡綜合癥”的主要發(fā)病癥狀和致病的可能性因素，但對(duì)于該病的原發(fā)性病原和病因至今尚未有確切的定論。
　　
　　1南美白對(duì)蝦“早期死亡綜合癥”的發(fā)病特點(diǎn)
　　
　　2010～2012年期間，筆者在海南調(diào)研了大量發(fā)生“早期死亡綜合癥”的蝦塘并走訪了眾多的養(yǎng)殖戶，通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)的觀察、采樣檢測(cè)及與養(yǎng)殖技術(shù)人員的交流，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)和不同季節(jié)發(fā)生的“早期死亡綜合癥”都有許多相同的發(fā)病特點(diǎn)。并采集了放養(yǎng)30天左右攝食生長(zhǎng)正常的和患“早期死亡綜合癥”的南美白對(duì)蝦活體樣品。正常組對(duì)蝦采自海南省文昌市林梧養(yǎng)殖場(chǎng)的6口池塘，患病組對(duì)蝦采自海南省澄邁縣的馬村養(yǎng)殖場(chǎng)和南港養(yǎng)殖場(chǎng)的6口池塘。對(duì)蝦樣品通過(guò)無(wú)菌操作和低溫保存，帶回實(shí)驗(yàn)室分別進(jìn)行肝胰臟和中腸組織切片、肝胰臟的弧菌和可培養(yǎng)細(xì)菌的檢測(cè)，并采用PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）方法檢測(cè)白斑綜合癥病毒（WSSV）、桃拉綜合癥病毒（TSV）和皮下及造血器官壞死病毒（IHHNV）三種特定病毒。現(xiàn)將“早期死亡綜合癥”的發(fā)病特點(diǎn)和相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果歸納整理如下，旨在為南美白對(duì)蝦“早期死亡綜合癥”的防治及流行病學(xué)的研究提供參考。
　　
　　1.1對(duì)蝦“早期死亡綜合癥”的主要外觀癥狀
　　
　　蝦苗放養(yǎng)10-30天為該病的高發(fā)期，患病對(duì)蝦體色呈白濁并微紅，多數(shù)情況下肝胰臟異常腫大，質(zhì)地松軟，顏色呈淡白或淡黃色；部分患病對(duì)蝦的肝胰臟明顯萎縮，質(zhì)地變硬（圖1）。發(fā)病期間，患病對(duì)蝦通常在池塘水面緩慢游動(dòng)或趴伏于池塘邊坡上，失去食欲，胃、腸充塞度極差，嚴(yán)重者胃腸呈紅色。該病病情發(fā)展十分迅速，死亡率和排塘率極高，從發(fā)現(xiàn)少量病蝦到排塘，時(shí)間最短的僅2-3天。患病對(duì)蝦樣品經(jīng)PCR方法檢測(cè)，通常未被檢出攜帶WSSV、TSV、IHHNV等特定病毒，但肝胰臟和腸組織勻漿經(jīng)TCBS培養(yǎng)基的培養(yǎng)，均被檢測(cè)出有大量的弧菌。對(duì)蝦的發(fā)病通常與蝦池藻類的老化死亡有密切關(guān)系，檢測(cè)池水的弧菌數(shù)量較大，且往往是綠色弧菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。美國(guó)亞歷桑那大學(xué)的Lightner教授在2012年8月的曼谷研討會(huì)上指出，到目前為止，從越南和中國(guó)采集的患病對(duì)蝦樣本的組織濾液在人工感染試驗(yàn)中無(wú)法證實(shí)該病是由病毒引起的，病蝦樣品的PCR測(cè)試結(jié)果顯示，“早期死亡綜合癥”與白斑綜合癥病毒、黃頭病毒、傳染性肌肉壞死病毒和桃拉綜合癥病毒沒有直接的關(guān)系。2013年3月，拜耳（四川）動(dòng)物保健有限公司的劉濤博士應(yīng)Chalor教授的邀請(qǐng)前往泰國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)參觀訪問(wèn)，據(jù)Chalor教授介紹，他們的實(shí)驗(yàn)中心在一年多前就嘗試用病蝦作為實(shí)驗(yàn)材料開展人工感染試驗(yàn)，甚至用病蝦的肝胰臟勻漿濾液注射到健康的對(duì)蝦，其結(jié)果也不能導(dǎo)致健康對(duì)蝦的發(fā)病，認(rèn)同“早期死亡綜合癥”不是由病毒引起的觀點(diǎn)。
　　

　　
　　圖1示患病對(duì)蝦肝胰臟的腫大和萎縮
　　
　　1.2對(duì)蝦肝胰臟和中腸的組織學(xué)觀察
　　
　　通過(guò)顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)正常對(duì)蝦和患病對(duì)蝦肝胰臟和中腸的組織形態(tài)有很大的差異。正常對(duì)蝦的肝胰臟為復(fù)管狀腺，由多級(jí)分支的肝小管組成，肝小管管壁由單層細(xì)胞構(gòu)成，管腔呈五角或四角星形，腺細(xì)胞正常（圖2）；中腸管壁組織厚度均勻、致密，腸腔中充滿內(nèi)含物（圖4）。患病對(duì)蝦肝胰臟的腺細(xì)胞間隙變大，腺細(xì)胞核變小，腺細(xì)胞有不同程度的自溶現(xiàn)象，肝小管變形（圖3）；中腸腸壁變薄，腸粘膜脫落并散落于腸腔內(nèi)，腸腔中沒有內(nèi)含物（圖5）。
　　

　　
　　圖2正常南美白對(duì)蝦的肝小管橫切面

　　圖3患病南美白對(duì)蝦的肝小管橫切面
　　

　　
　　圖4正常南美白對(duì)蝦的中腸橫切面圖

　　5患病南美白對(duì)蝦的中腸橫切面
　　
　　1.3對(duì)蝦肝胰臟弧菌和可培養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量
　　
　　通過(guò)對(duì)生長(zhǎng)正常和患病對(duì)蝦的活體樣品體內(nèi)細(xì)菌的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩者的肝胰臟和腸道均有大量的細(xì)菌，但兩者細(xì)菌的數(shù)量和種類有顯著的差異。正常組對(duì)蝦肝胰臟的可培養(yǎng)細(xì)菌密度范圍為1.59×10⁶～5.83×10⁶cfu·g^-1，平均3.18×10⁶cfu·g^-1；弧菌密度為1.46×10⁵～2.99×10⁵cfu·g^-1，平均1.97×10⁵cfu·g^-1，占可培養(yǎng)細(xì)菌的7.64%；在TCBS培養(yǎng)平板上觀察，黃色弧菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，密度范圍為1.20×10⁵～2.86×10⁵cfu·g^-1；綠色弧菌的密度范圍為0.6×10⁴～3.9×10⁴cfu·g^-1，黃色弧菌的密度是綠色弧菌密度的10.25倍，其中的一株黃色弧菌為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株。

　　
　　患病對(duì)蝦肝胰臟的可培養(yǎng)細(xì)菌密度為2.87×10⁶～8.24×10⁷cfu·g^-1，平均2.71×10⁷ cfu·g^-1；弧菌密度為1.28×10⁶～3.59×10⁶cfu·g^-1，平均1.87×10⁶cfu·g^-1，是正常對(duì)蝦組的9.5倍，弧菌占可培養(yǎng)細(xì)菌的15.89%；在TCBS培養(yǎng)平板上觀察，綠色弧菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，密度范圍為1.02×10⁶～2.97×10⁶cfu·g^-1，平均1.42×10⁶cfu·g^-1，黃色弧菌的密度為0.2×10⁶～0.63×10⁶cfu·g^-1，綠色弧菌密度是黃色弧菌密度的3.16倍，其中的一株綠色弧菌為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株。

　　
　　兩株優(yōu)勢(shì)菌株均為革蘭氏陰性菌，菌體為彎桿狀，無(wú)芽孢，對(duì)弧菌抑制劑O/129均敏感，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，生長(zhǎng)需NaCl，可利用D-甘露醇，在TCBS平板上分別形成黃色和綠色的圓形菌落，具有弧菌屬的典型特征。
　　
　　今年3月，Chalor教授向拜耳（四川）動(dòng)物保健有限公司的劉濤博士介紹，他們?cè)谔﹪?guó)和其它地區(qū)也發(fā)現(xiàn)病蝦的肝胰臟內(nèi)有大量的細(xì)菌存在。他還向記者透露，Lightner教授最近發(fā)現(xiàn)了一些有趣的現(xiàn)象，在越南的一些區(qū)域，他們?cè)凇霸缙谒劳鼍C合癥”病蝦體內(nèi)分離出一些細(xì)菌，目前還在研究試驗(yàn)當(dāng)中，看是否就是這些細(xì)菌導(dǎo)致對(duì)蝦的“早期死亡綜合癥”。
　　
　　1.4兩株弧菌優(yōu)勢(shì)菌株對(duì)南美白對(duì)蝦的人工感染
　　
　　我們從患病對(duì)蝦的肝胰臟分離出一株弧菌優(yōu)勢(shì)菌株，在TCBS培養(yǎng)基上其菌斑的顏色呈綠色；正常對(duì)蝦的弧菌優(yōu)勢(shì)菌株則是一株黃色弧菌，在TCBS培養(yǎng)基上其菌斑的顏色呈黃色。在實(shí)驗(yàn)室條件下，分別用兩株弧菌優(yōu)勢(shì)菌株以不同的密度梯度接種到水族箱對(duì)健康的南美白對(duì)蝦幼蝦進(jìn)行人工感染試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：沒有接種任何菌株的對(duì)照組的對(duì)蝦攝食生長(zhǎng)正常，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，水體和對(duì)蝦肝胰臟內(nèi)均檢出少量的黃色弧菌，但未檢出綠色弧菌；在接種綠色弧菌的試驗(yàn)組中，只要水中綠色弧菌的接種密度達(dá)到0.5×10⁴cfu·mL^-1時(shí)，水族箱的對(duì)蝦從接種的第3天開始出現(xiàn)死亡，10天內(nèi)的累計(jì)死亡率達(dá)到72%；當(dāng)接種密度為2.5×10⁴cfu·mL^-1時(shí)，10天內(nèi)的累計(jì)死亡率達(dá)到98%。死亡對(duì)蝦的外表癥狀與“早期死亡綜合癥”基本一致，出現(xiàn)肝胰臟腫大、顏色淡黃、失去食欲、空腸空胃等典型癥狀，并從死亡幼蝦的肝胰臟檢測(cè)到大量的綠色弧菌和少量的黃色弧菌；在接種黃色弧菌的試驗(yàn)組中，試驗(yàn)期間幼蝦攝食生長(zhǎng)基本正常，僅有少量幼蝦死亡，10天內(nèi)的累計(jì)死亡率為15.5%～22%，死亡幼蝦沒有“早期死亡綜合癥”的典型癥狀，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，在養(yǎng)殖水體和幼蝦的肝胰臟中均檢出大量的黃色弧菌，但未檢出綠色弧菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩株弧菌優(yōu)勢(shì)菌株在養(yǎng)殖水體中均可經(jīng)口感染對(duì)蝦的消化器官，有很強(qiáng)的感染能力，并可在對(duì)蝦的消化器官中定植并生長(zhǎng)繁殖。通過(guò)比較兩組對(duì)蝦的累計(jì)死亡率，筆者認(rèn)為綠色弧菌比黃色弧菌具有更強(qiáng)的毒力。本次人工感染試驗(yàn)是在實(shí)驗(yàn)室的條件下進(jìn)行，由于受光照的限制，養(yǎng)殖水體中沒有藻類，說(shuō)明在沒有藻類存在情況下，對(duì)蝦同樣會(huì)出現(xiàn)“早期死亡綜合癥”的癥狀；本次實(shí)驗(yàn)設(shè)置的綠色弧菌最小接種密度為5.0×10³cfu·mL^-1，10天內(nèi)幼蝦的累計(jì)死亡率達(dá)到72%，綠色弧菌在南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中的安全密度應(yīng)少于5.0×103cfu•mL-1。
　　
　　2“早期死亡綜合癥”的防控措施
　　
　　南美白對(duì)蝦“早期死亡綜合癥”的發(fā)生除了與大量的弧菌感染有密切關(guān)系之外，也和養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境差、藻毒素的影響以及對(duì)蝦自身體質(zhì)虛弱等諸多因素有關(guān)。因此，該病的防控是一項(xiàng)綜合系統(tǒng)工程，應(yīng)同時(shí)從改善養(yǎng)殖環(huán)境、控制和消除病原和提高對(duì)蝦自身免疫功能等多方面著手才能收到較理想的效果。經(jīng)過(guò)兩年來(lái)的生產(chǎn)實(shí)踐證明，只要方法對(duì)頭，措施得力，對(duì)蝦“早期死亡綜合癥”仍然是可防可控的，許多成功的養(yǎng)殖案例已證實(shí)了這一點(diǎn)。
　　
　　2.1定期檢測(cè)養(yǎng)殖水體中的弧菌密度
　　
　　綜合分析其發(fā)病的特點(diǎn)，筆者認(rèn)為“早期死亡綜合癥”是對(duì)蝦一種細(xì)菌性的消化系統(tǒng)疾病，綠色弧菌的大量感染導(dǎo)致對(duì)蝦消化道的菌群失衡，危害和損傷對(duì)蝦的消化器官，使對(duì)蝦失去食欲并最終導(dǎo)致對(duì)蝦的大量死亡。在以往發(fā)生“早期死亡綜合癥”的蝦池中，養(yǎng)殖水體中通常被檢測(cè)出有大量的綠色弧菌。建議在蝦苗放養(yǎng)前要檢查水中弧菌的密度，若水中綠色弧菌密度超過(guò)3.0×10² cfu·mL^-1或總弧菌密度超過(guò)5.0×10³ cfu·mL^-1，應(yīng)進(jìn)行水體消毒和適量施用有益微生物后再放苗；養(yǎng)殖期間每5～7天檢測(cè)一次，若發(fā)現(xiàn)水中弧菌超標(biāo)，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行水體消毒，24小時(shí)后再適量施用有益微生物。
　　
　　2.2培養(yǎng)和維持良好的水色
　　
　　池塘水色是水中單細(xì)胞藻類密度和種類組成的綜合表現(xiàn)。藻類的光合作用可增加水中的溶解氧，吸收水中無(wú)機(jī)氮、磷和二氧化碳，對(duì)改善水質(zhì)和促進(jìn)池塘物質(zhì)循環(huán)起著至關(guān)重要的作用。因?yàn)橐酝�發(fā)生“早期死亡綜合癥”的池塘通常與“倒藻”有密切關(guān)系，所以許多養(yǎng)殖戶忽略培藻環(huán)節(jié)，采取清水放苗，筆者認(rèn)為這是一種不可取的做法。放苗前的培藻施肥應(yīng)遵循少量多次的原則，透明度以30～50厘米為宜，水色以黃綠色為佳。養(yǎng)殖期間若發(fā)現(xiàn)水色色澤變暗、池水泡沫增多且表層漂浮少量死藻的現(xiàn)象時(shí)，說(shuō)明藻類開始老化，應(yīng)及時(shí)適量的換水，以維持藻類的正常生長(zhǎng)，避免“倒藻”現(xiàn)象的發(fā)生。
　　
　　2.3維持池塘微生物的多樣性和數(shù)量的相對(duì)穩(wěn)定
　　
　　在對(duì)蝦養(yǎng)殖的池塘生態(tài)系統(tǒng)中，微生物是不可缺少的生物類群，它們?cè)诔靥恋奈镔|(zhì)循環(huán)、能量傳遞和水體凈化等方面發(fā)揮著極其重要的作用。通常情況下，養(yǎng)殖水體的微生物以好氧微生物為主，它們可以分解和利用水中的有機(jī)物，凈化水質(zhì)和底質(zhì)。在對(duì)蝦養(yǎng)殖的日常生產(chǎn)管理中，若強(qiáng)力增氧和保持有機(jī)碎屑在水中呈懸浮狀態(tài)，不僅可促進(jìn)好氧微生物的生長(zhǎng)繁殖，強(qiáng)化養(yǎng)殖水體的自凈功能，而且可限制其它兼性厭氧微生物的生長(zhǎng)繁殖。許多弧菌屬的細(xì)菌是條件性致病菌，多屬于兼性厭氧型微生物，當(dāng)其在水中密度較大和對(duì)蝦體質(zhì)較弱時(shí)，容易感染對(duì)蝦并造成危害。因此，在對(duì)蝦養(yǎng)殖過(guò)程應(yīng)定期檢測(cè)池水中的總細(xì)菌密度，養(yǎng)殖早期總細(xì)菌密度以3.0×10⁴～5.0×10⁴ cfu·mL^-1較為適宜；養(yǎng)殖中、后期隨著水中懸浮有機(jī)物的增加，總細(xì)菌密度會(huì)相應(yīng)增大，以1.0×10⁵～2.0×10⁵ cfu·mL^-1較為理想。許多的成功養(yǎng)殖實(shí)例證明，當(dāng)水中總細(xì)菌密度較大時(shí)，池塘水質(zhì)通常比較穩(wěn)定，對(duì)蝦的攝食生長(zhǎng)也較為正常。另外，保持池塘微生物的物種多樣性也極為重要，種類組成越復(fù)雜，更利維持總細(xì)菌數(shù)量的穩(wěn)定；若微生物的種類過(guò)于單一，天氣或其它環(huán)境因子的突然變化均可能會(huì)導(dǎo)致池塘微生物數(shù)量的大幅下降。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，許多養(yǎng)殖業(yè)者通常采取多種有益微生物制劑的混合使用或交替使用，這對(duì)保持池塘微生物的物種多樣性和數(shù)量的穩(wěn)定有很好的作用和效果。近年一些養(yǎng)殖業(yè)者喜歡采用“老水”養(yǎng)蝦，并獲得較好的養(yǎng)殖效果。所謂“老水”養(yǎng)蝦就是將上一茬養(yǎng)蝦效果最佳和水質(zhì)最為穩(wěn)定的一池水留下來(lái)，等到其它池塘進(jìn)水準(zhǔn)備放養(yǎng)下一茬蝦時(shí)，再將這池“老水”分別抽到每一口蝦池，相當(dāng)于給每口準(zhǔn)備放苗的池塘接入菌種和藻種。“老水”中微生物的種類組成穩(wěn)定且比較理想，對(duì)當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境條件具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，筆者認(rèn)為這是一種可取的做法。
　　
　　2.4實(shí)行科學(xué)的投喂管理
　　
　　科學(xué)的投喂管理的宗旨是盡量避免飼料的過(guò)量投喂。目前許多養(yǎng)殖戶擔(dān)心對(duì)蝦吃不飽而影響其生長(zhǎng)速度，只要看見餌料觀察網(wǎng)里沒有飼料就在下一餐次加料，而且每一天加料的幅度很大，希望對(duì)蝦長(zhǎng)得更快一些，其實(shí)這種做法的結(jié)果往往是事與愿違。南美白對(duì)蝦有貪吃的習(xí)性，雖然飼料吃完了，也被消化了，但營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并沒有完全被對(duì)蝦所吸收利用，很多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被當(dāng)作代謝產(chǎn)物而排到水里，不僅造成飼料的浪費(fèi)，污染了水質(zhì)，而且還會(huì)加重對(duì)蝦消化系統(tǒng)的負(fù)擔(dān)，長(zhǎng)期如此勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致對(duì)蝦消化器官的功能紊亂。其實(shí)這種現(xiàn)象早在2000年海南剛開始養(yǎng)殖南美白對(duì)蝦的時(shí)候就發(fā)生過(guò)，很多對(duì)蝦養(yǎng)了20天左右，攝食量開始迅速增加，但經(jīng)過(guò)連續(xù)幾天的大幅度加料后，對(duì)蝦的消化系統(tǒng)就開始出現(xiàn)問(wèn)題，隨后池蝦的食欲就大幅下降并發(fā)病死亡。今年3月，泰國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)Chalor教授向拜耳動(dòng)物保健有限公司的劉濤博士介紹，目前泰國(guó)也有類似的情況發(fā)生，如果管理方面過(guò)于激進(jìn)，比如放養(yǎng)密度越高，投料越多，就越容易發(fā)生“早期死亡綜合癥”疫情。因此，在確定飼料投喂量時(shí)，既要參照餌料觀察網(wǎng)的飼料攝食情況，同時(shí)還要結(jié)合不同生長(zhǎng)階段對(duì)蝦的現(xiàn)存量、個(gè)體規(guī)格和相應(yīng)的日投餌率來(lái)計(jì)算理論投餌量，以此來(lái)修正經(jīng)驗(yàn)投餌量，盡量避免飼料的過(guò)量投喂。
　　
　　2.5優(yōu)化對(duì)蝦消化道的菌群組成
　　
　　乳酸菌屬于非致病菌，是一類兼性厭氧微生物，它們產(chǎn)生的酸性物質(zhì)和代謝產(chǎn)物不僅能強(qiáng)化對(duì)蝦的消化吸收功能，增強(qiáng)食欲和促進(jìn)生長(zhǎng)，而且可抑制對(duì)蝦消化道弧菌的生長(zhǎng)繁殖。最近我們從一些養(yǎng)殖效果較佳、對(duì)蝦生長(zhǎng)情況較好的池塘采集了許多活體對(duì)蝦樣品，發(fā)現(xiàn)正常對(duì)蝦的消化道有大量的乳酸菌存在，其中某些乳酸菌是對(duì)蝦消化道的優(yōu)勢(shì)菌株，可占到消化道總細(xì)菌數(shù)量的40%。在實(shí)驗(yàn)室的弧菌平板培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)這些乳酸菌對(duì)綠色弧菌和黃色弧菌都有顯著的抑制效果，抑菌圈的大小可與許多抗菌素相媲美。在對(duì)蝦養(yǎng)殖過(guò)程中不定期地使用乳酸菌拌料投喂對(duì)蝦，將有助于優(yōu)化對(duì)蝦消化道的菌群組成，對(duì)增強(qiáng)對(duì)蝦食欲和預(yù)防消化道疾病均有很好的效果。