文/圖 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 王雪鵬、浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所 柴雪良 閆茂倉、山東省濟(jì)寧市漁業(yè)局漁業(yè)科 謝召勇
中國水產(chǎn)頻道報(bào)道，本文從江蘇文蛤養(yǎng)殖區(qū)發(fā)病文蛤和養(yǎng)殖水體中分離到1株優(yōu)勢菌，通過對該菌形態(tài)、生理生化特征及致病性進(jìn)行了初步研究。結(jié)果顯示該菌株為革蘭氏陰性菌，直桿狀，生理生化指標(biāo)為：賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、硝酸鹽還原、甘露糖、氧化酶、甲基紅陽性，精氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、水楊素、V.P陰性。結(jié)合形態(tài)、生理生化鑒定結(jié)果，最后鑒定該菌株為哈氏弧菌。 從藥敏試驗(yàn)結(jié)果來看，該哈氏弧菌對阿米卡星、復(fù)方新諾明、卡那霉素、菌必治、先鋒必、鏈霉素、慶大霉素、新霉素、頭孢拉定9種藥物高度敏感；對氟哌酸、利福平、頭孢噻吩、頭孢氨芐、氨芐青霉素5種藥物中度敏感；對四環(huán)素、青霉素G低度敏感。 文蛤是我國沿海常見的一種重要經(jīng)濟(jì)貝類，因其肉質(zhì)細(xì)嫩、營養(yǎng)豐富，深受國內(nèi)外消費(fèi)者歡迎，是出口創(chuàng)匯的重要水產(chǎn)品之一。但是近十幾年來，隨著文蛤養(yǎng)殖規(guī)模的逐年擴(kuò)大，養(yǎng)殖環(huán)境惡化導(dǎo)致微生物疾病的流行而引發(fā)的養(yǎng)殖文蛤的大規(guī)模死亡屢屢發(fā)生，已造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。而弧菌是導(dǎo)致文蛤發(fā)病的主要致病菌，發(fā)病的文蛤表現(xiàn)為不能潛入沙中，雙殼不能緊閉，殼邊緣有許多粘液，消化道內(nèi)細(xì)菌大量繁殖，國內(nèi)外的報(bào)道有副溶血弧菌和弗氏弧菌，鄭國興等發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致江蘇沿岸文蛤大規(guī)模死亡的病原菌為溶藻弧菌，而哈氏弧菌作為文蛤病原菌的研究還未見報(bào)道。 本研究對發(fā)病文蛤優(yōu)勢菌株進(jìn)行分離、鑒定，并進(jìn)行人工感染試驗(yàn)和藥物敏感性分析，探討分析導(dǎo)致江蘇呂泗文蛤大規(guī)模死亡的病原，旨在為文蛤疾病研究提供理論依據(jù)，為文蛤健康養(yǎng)殖提供一些參考資料。
材料與方法 1、發(fā)病文蛤 于2013年9月份江蘇文蛤發(fā)病高峰期，采集病狀特征明顯、瀕臨死亡的文蛤。患病文蛤（殼長2cm左右）花色暗淡無光澤，表皮部分脫落、表面粘液較少，解剖發(fā)現(xiàn)外套膜萎縮，閉殼肌松弛、開合無力，有些發(fā)爛發(fā)白，軟體部消瘦，顏色淡紅，血管無色，部分病蛤腮黏液明顯增多。 2、組織切片與觀察 解剖病貝個體，取部分外套膜（組織塊大小為1mm3），樣品用Bouin氏液固定3次，然后移入70%酒精中（可放于4℃冰箱保存），梯度乙醇脫水，石蠟浸透與包埋，切片，厚度7-8μm，蠟帶經(jīng)展片劑展開，貼于事先涂有粘片劑的載玻片上，烤片機(jī)烘干即可用蘇木精和1%伊紅染色，最后用乙醇和二甲苯脫色，待玻片上樣品稍干燥，用中性樹膠封片，NikonＥ600顯微鏡下觀察并拍照，同時固定正常貝外套膜組織作為對照組，以作對比觀察。 3、分離方法 無菌鹽水洗凈，用70%的酒精棉球?qū)w表擦拭消毒，無菌手術(shù)刀開啟，取肝胰臟等部位無菌勻漿器中勻漿處理，zobell 2216E平板和TCBS平板劃線接種，28℃培養(yǎng)24h后，選取優(yōu)勢菌落進(jìn)行重復(fù)劃線純化，純培養(yǎng)物于4℃冰箱中保存。 4、人工感染試驗(yàn) 人工感染試驗(yàn)在20L水族箱中進(jìn)行，條件為溫度28℃，鹽度26.4，pH8.2，連續(xù)充氣，每組放16只2 cm大小的文蛤。每天換水1次，試驗(yàn)組調(diào)節(jié)水體中細(xì)菌濃度為108cfu/mL，每日投單胞藻1次；對照組不加入菌體，按上述方法飼養(yǎng)；連續(xù)觀察12d，紀(jì)錄死亡狀況，并進(jìn)行解剖和病原的再分離以確定是否死于攻毒活菌引起的感染。 5、細(xì)菌生化鑒定 按一般細(xì)菌常用鑒定方法進(jìn)行分離菌的生物學(xué)性狀測定，包括革蘭氏染色、形態(tài)觀察、生理生化特性測定（所用試劑購自杭州天和微生物試劑有限公司）。 6、藥敏試驗(yàn) 采用紙片瓊脂擴(kuò)散法，在zobell 2216E培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，測量抑菌圈直徑。藥敏紙片（杭州天和微生物試劑有限公司），共19種抗菌藥物。 結(jié)果與分析 1、外套膜組織病理學(xué)變化 健康文蛤的外套膜是由上皮細(xì)胞、結(jié)締組織、肌纖維及分泌細(xì)胞組成，邊緣膜由單層柱狀上皮細(xì)胞排列而成，中間充滿了豐富的結(jié)締組織；邊緣膜形成的各皺襞清楚，見圖1-1；發(fā)病文蛤外套膜發(fā)生腫脹，上皮層中杯狀細(xì)胞增多，部分上皮細(xì)胞發(fā)生水腫、破裂或萎縮，有的已經(jīng)脫落，邊緣膜突起內(nèi)及上皮下結(jié)締組織增生，呈雜亂狀態(tài)；肌纖維細(xì)胞排列紊亂，有的已斷裂；結(jié)締組織發(fā)生空泡變性，組織中血淋巴細(xì)胞增多，見圖1-2。 2、細(xì)菌分離及其形態(tài)特征 經(jīng)分離純化后，從病蛤中分離到1株優(yōu)勢菌，分離到的菌株均為革蘭氏陰性直桿菌（圖2-1），菌體直或稍彎，無莢膜，靠鞭毛運(yùn)動。在TCBS（硫代硫酸鈉-檸檬酸鹽-膽鹽）瓊脂平板上培養(yǎng)18h后，該分離菌株形成黃色扁平的大菌落（圖2-2）。 3、人工感染試驗(yàn) 表1顯示，該菌株感染病死率為100%。人工感染7d后，文蛤開始出現(xiàn)死亡，9d后全部死亡。于是初步判定2013年9月江蘇文蛤大批死亡主要是以該分離菌為主要病原體的傳染病所造成。 4、分離菌株生化特性 細(xì)菌分離株在40℃以上和4℃以下不生長，無鹽不生長，在含8%以上NaCl胨水中不生長，葡萄糖不產(chǎn)氣、精氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、肌醇、水楊素、V.P 陰性，賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、硝酸鹽還原、甘露糖、氧化酶、甲基紅陽性，對弧菌抑制劑O/129（150μg）敏感，這些特性相關(guān)文獻(xiàn)對哈氏弧菌的描述基本一致，認(rèn)為分離菌株為哈氏弧菌。 5、藥物敏感性試驗(yàn) 利用紙片法測定16種抗菌藥物對致病菌的抑制作用，由結(jié)果可知，分離株對阿米卡星等9種藥物高度敏感，對氟哌酸等5種藥物中度敏感，對青霉素產(chǎn)生耐藥性。 討論 哈氏弧菌感染海水養(yǎng)殖動物的報(bào)道比較多，但導(dǎo)致貝類病害發(fā)生的報(bào)道卻很少。本次樣品采集是在高水溫期，表明哈氏弧菌是容易高溫環(huán)境下生長并導(dǎo)致海水養(yǎng)殖動物的弧菌病，通過人工感染實(shí)驗(yàn)可知，感染后的實(shí)驗(yàn)文蛤出現(xiàn)明顯的病癥：花色暗淡無光澤，表皮部分脫落、表面粘液較少，解剖發(fā)現(xiàn)外套膜萎縮，閉殼肌松弛、開合無力，有些發(fā)爛發(fā)白，軟體部消瘦，顏色淡紅，血管無色，部分病蛤腮黏液明顯增多，這與鄧歡對扇貝的人工感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果極為相似，死亡率高達(dá)100%，從浸泡感染方式發(fā)病文蛤處分離到與自然發(fā)病相同的細(xì)菌，因此可以確定該分離株是文蛤發(fā)病的病原體，為文蛤暴發(fā)性疾病的預(yù)防和控制贏得了寶貴的時間。 從藥敏試驗(yàn)結(jié)果來看，該哈氏弧菌對阿米卡星、復(fù)方新諾明、卡那霉素、菌必治、先鋒必、鏈霉素、慶大霉素、新霉素、頭孢拉定9種藥物高度敏感；對氟哌酸、利福平、頭孢噻吩、頭孢氨芐、氨芐青霉素5種藥物中度敏感；對四環(huán)素、青霉素G低度敏感，因此在疾病發(fā)生時可以適量投放一些抗菌性藥物。 值得注意的是目前在養(yǎng)殖過程中誤用、濫用抗生素和消毒劑等，影響了水體中微生態(tài)環(huán)境的平衡，可能導(dǎo)致了一些耐藥菌株的出現(xiàn)，但是合理選擇和使用有效的抗生素仍是目前和近期內(nèi)控制疾病主要方法。為了更好的預(yù)防病害發(fā)生，塘養(yǎng)或池養(yǎng)文蛤（灘涂除外）可以適量投放微生態(tài)制劑，如：芽孢桿菌和光合細(xì)菌，以達(dá)到生態(tài)防治的目的。 中國水產(chǎn)頻道獨(dú)家報(bào)道，轉(zhuǎn)載請說明出處《水產(chǎn)前沿》雜志 www.fuqitext.com ，違者追究法律責(zé)任， 謝謝合作。 【關(guān)鍵字】：養(yǎng)殖 病害 水產(chǎn)養(yǎng)殖 |
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