文/圖 華中農業大學 陳昌福、鹽城裕達飼料有限公司 陳亮波 郭慶 孟憲東、長江大學動物科學學院 徐展 孫健

　　

　　中國水產頻道獨家報道：

　　

　　一、材料與方法

　　

　　1、供試藥物

　　

　　本次試驗中用于投喂黃顙魚的藥物是屬于喹諾酮類的煙酸諾氟沙星（Norfloxacin nicotinate），華北制藥總廠生產，含量為95.5%，批號：131208。用于測定分離菌株藥物感受的藥物包括屬于喹諾酮類的恩諾沙星（Enrofloxacin），華北制藥總廠生產，含量為98.8%，批號：130302。屬于酰胺醇類的氟苯尼考（Florfenicol），華北制藥總廠生產，含量為98.9%，批號：130208。屬于氨基糖苷類的硫酸新霉素（Neomycin Sulfate），宜昌三峽制藥有限公司生產，含量為98.0%，批號：130201。屬于四環素類的鹽酸多西環素（Doxycycline Hcl），是廣東華南藥業集團有限公司生產，含量為96.8%，批號：130311。

　　

　　2、試驗魚及其飼養條件

　　

　　本研究中的黃顙魚由鹽城裕達水產養殖公司提供。選擇健康、活潑無外傷的黃顙魚作試驗魚。在每個2.0m×2.0m×1.6m的網箱（圖1）中飼養50尾平均體重為（22.0±5.0）g的黃顙魚，每天投喂相當于魚體重1.5%的人工配合飼料（鹽城裕達飼料有限公司生產的黃顙魚專用配合飼料）。馴養10d，待供試黃顙魚適應環境，并確認無疾病癥狀后，開始試驗。試驗期間池塘中日均換水量約20.0%左右。飼養水溫變化幅度為（21±3）℃。

　　

　　3、藥物餌料的制備與投喂

　　

　　將煙酸諾氟沙星按25.0mg/kg魚體重的用藥量，將藥物首先均勻地拌和在熟化的淀粉糊（圖2）中，再均勻地拌合在顆粒飼料中制作成藥餌（圖3）。添加藥物的餌料投喂3個網箱中的黃顙魚，作為試驗組；以未添加藥物的餌料喂養1個網箱中的黃顙魚，作為對照組。每天投喂1次藥餌，連續投喂5d。停止投喂藥物餌料1d后，從供試魚消化道中采樣。

　　

　　4、細菌分離

　　

　　在投喂藥物餌料結束后的第2d，從每個試驗和對照網箱中各隨機撈取5尾黃顙魚，在無菌條件下，將供試魚體用酒精消毒后解剖，從其腸道中采樣并接種在鋪有腦心浸液瓊脂培養基（BHIA，Difco）的平板上，從每尾魚消化道中分離的細菌接種3個平板。將接種后的平板置于25℃恒溫培養箱中培養48h后，從每尾魚腸道中接種的3個平板中，共隨機挑取10個菌落，從3個試驗組黃顙魚消化道中共分離150個菌株，對照組黃顙魚消化道中共分離50個菌株。分別轉接在BHIA平板中，在25℃恒溫培養箱中進行分離菌株的純培養。培養48h后，用滅菌生理鹽水洗下平板中的菌落，并調節細菌濃度為106cfu/mL，冷藏備用。

　　

　　

　　依日本化學療法學會的方法進行。首先將各種抗菌藥物以適宜溶媒溶解后，再用滅菌生理鹽水分別稀釋至1000.0mg/L的濃度。然后在無菌條件下，用滅菌后的腦心浸液培養基（BHI，Difco）將藥物稀釋10倍，從而使培養基中藥物的濃度達到100.0mg/L的濃度。再用定量移液槍向每支盛有2.9mL BHI培養基的試管中加入2.9mL含有藥物的培養基，將試管在混懸器上混合均勻后，從中吸取2.9mL含有藥物的BHI培養基加到下一試管中，以此類推制作成藥物濃度分別為100.0mg/L、50.0mg/L、25.0mg/L……0.025mg/L的2倍稀釋藥物系列培養基試管。最后，定量吸取0.1mL濃度約為1.2×106cfu/mL活菌液（比濁法測定）加入上述每支試管中，搖勻。置于25℃條件下培養72h，經肉眼觀察證實無細菌生長試管中的最低藥物濃度，即為藥物的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

　　

　　6、最小殺菌濃度（MBC）的測定

　　

　　從各種藥物的MIC濃度以及高于MIC濃度的試管中分別取0.1mL培養液，接種于BHIA（Difco）培養基平皿中，置36℃條件下培養5d，沒有菌落出現的相應試管中的最低藥物濃度，即判為這種藥物的最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentrations，MBC）。

　　

　　二、結果

　　1、用藥前后菌株MIC的變化

　　

　　從試驗和對照黃顙魚消化道中分離菌株對各種抗菌藥物的MIC測定結果如表1所示。由表1可以看出，煙酸諾氟沙星對從對照組黃顙魚消化道中分離的50個菌株的MIC分別為0.78-6.25μg/mL，從連續投喂5d煙酸諾氟沙星藥物餌料后的黃顙魚消化道中分離的150個菌株，其MIC上升至3.13-50.0μg/mL。對屬于同一類的恩諾沙星，對照組黃顙魚消化道中分離的50個菌株的MIC為0.39-12.5μg/mL，而對從試驗組黃顙魚消化道中分離的150個菌株的MIC上升1.56-50.0μg/mL。硫酸新霉素、鹽酸多西環素和恩諾沙星等3種抗菌藥物，無論是對從試驗還是對照組黃顙魚消化道中分離菌株的MIC均沒有明顯變化。

　　

　　2、用藥前后菌株MBC的變化

　　

　　從試驗和對照黃顙魚消化道中分離菌株對各種抗菌藥物的MBC測定結果如表2所示。

　　

　　由表2可以看出，煙酸諾氟沙星對從對照組黃顙魚消化道中分離的50個菌株的MBC分別為3.13-12.5μg/mL，從連續投喂5d煙酸諾氟沙星藥物餌料后的黃顙魚消化道中分離的150個菌株，其MBC上升至6.25-25.0μg/mL。對屬于同一類的恩諾沙星，對照組黃顙魚消化道中分離的50個菌株的MBC為1.56-12.5μg/mL，而對從試驗組黃顙魚消化道中分離的150個菌株的MBC上升1.56-25.0μg/mL。氟苯尼考對試驗和對照黃顙魚消化道中分離菌株的MBC均為0.39-3.13μg/mL；硫酸新霉素的MBC為3.13-25.0μg/mL；鹽酸多西環素的MBC均為6.25-50.0μg/mL。即無論是對從試驗還是對照組黃顙魚消化道中分離菌株的MBC均沒有明顯變化。

　　

　　

　　已經有大量的研究結果證明，對魚類使用抗菌素與對其他動植物使用抗菌素一樣，容易導致致病菌產生耐藥性。本研究中經過連續5d給黃顙魚投喂煙酸諾氟沙星藥物餌料后，從試驗魚消化道中分離的菌株，至少是大部分菌株已經對該藥物的耐藥性明顯增強。說明給魚類投喂煙酸諾氟沙星容易導致養殖魚類消化道內的細菌產生耐藥性。

　　

　　細菌對不同抗菌素的敏感性是不同的，在本研究中的5種抗菌素中，從對照黃顙魚消化道中分離的菌株對氟苯尼考、硫酸新霉素均比較敏感，對煙酸諾氟沙星、恩諾沙星和鹽酸多西環素的敏感程度比較低。這可能是養殖業者以往預防和治療黃顙魚疾病過程中，使用這些藥物比較多的緣故。

　　

　　值得注意的是，給供試黃顙魚投喂煙酸諾氟沙星藥物餌料后，黃顙魚消化道中的細菌不僅對煙酸諾氟沙星的耐藥性有所上升，而且同屬于喹諾酮類抗菌藥物的恩諾沙星的耐藥性也相應上升了，即煙酸諾氟沙星與恩諾沙星之間顯示出了明顯地交叉耐藥性。而測定結果也證明了分離菌株對屬于氨基糖苷類的硫酸新霉素、屬于四環素類的鹽酸多西環素和屬于酰胺醇類氟苯尼考，均未出現明顯交叉耐藥性的現象。

　　

　　需要說明的是，本研究中未對分離菌株做種類鑒定，而對抗菌藥物的敏感性是與細菌的種類相關的。試驗與對照組中各種細菌種類的差異，以及因為種類差異導致的對藥物敏感性測定結果的影響，尚需要進一步研究。（由江蘇省水產三新工程項目（編號：D2013-5-1）資助，參考文獻略）

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