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標(biāo)題: 乳酸桿菌L1對(duì)致病弧菌的抑制作用 [打印本頁(yè)]
作者: cjlittlepig 時(shí)間: 2012-7-21 13:55
標(biāo)題: 乳酸桿菌L1對(duì)致病弧菌的抑制作用
摘自《南方水產(chǎn)》
摘要：以致病弧菌T1、T2為檢測(cè)菌，采用平板抑菌圈檢測(cè)法，研究乳酸桿菌L1及其代謝產(chǎn)物的抑菌能力。結(jié)果表明：L1發(fā)酵上清液對(duì)兩種弧菌的抑制效果和發(fā)酵液對(duì)弧菌的抑菌作用相似，即對(duì)弧菌T1 的抑制作用強(qiáng)于T2；L1發(fā)酵液對(duì)弧菌T1、T2的抑制能力強(qiáng)于上清液，表明乳酸桿菌及其代謝物質(zhì)對(duì)弧菌具有協(xié)同抑制作用；L1的發(fā)酵液經(jīng)3倍稀釋仍對(duì)弧菌T1 有抑制作用；乳酸桿菌L1生長(zhǎng)不同時(shí)期的代謝產(chǎn)物對(duì)弧菌的抑菌活性不同，代謝產(chǎn)物的抑菌能力在衰退期＞ 穩(wěn)定期＞ 生長(zhǎng)期；L1的發(fā)酵液經(jīng)沸水浴處理15min其抑菌活性不變，表明抑菌代謝物質(zhì)具有較好的耐熱性。
關(guān)鍵詞：乳酸桿菌；弧菌；抑菌能力
作者: cjlittlepig 時(shí)間: 2012-7-21 13:56
弧菌廣泛存在于養(yǎng)殖水體，是海水養(yǎng)殖動(dòng)物的主要病原菌，弧菌病是目前為止對(duì)養(yǎng)殖魚蝦危害最大，造成損失最嚴(yán)重的細(xì)菌性疾病之一。弧菌病可以發(fā)生在養(yǎng)殖的各個(gè)時(shí)期，因此防治對(duì)蝦弧菌病是養(yǎng)殖成敗的關(guān)鍵因素。防治細(xì)菌性疾病最常用的方法是使用抗菌素，但頻繁無(wú)節(jié)制的使用藥物，導(dǎo)致耐藥性菌株的產(chǎn)生并且造成環(huán)境的污染，因此，抗菌素的有效替代品的研究顯得尤為迫切，應(yīng)用生物及生態(tài)法防治疾病日益受到重視。大量的研究表明［1-7］，乳酸菌能夠調(diào)節(jié)機(jī)體腸道正常菌群，保持微生態(tài)平衡，提高食物消化率和生物價(jià)，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，提高機(jī)體的抗病能力，產(chǎn)生抑菌活性代謝產(chǎn)物，如乳酸菌肽、細(xì)菌素、乳酸、過(guò)氧化氫、乙酸等，對(duì)許多革蘭氏陽(yáng)性菌李斯特氏菌、芽孢菌、梭菌等及革蘭氏陰性菌大腸桿菌等有強(qiáng)烈的抑制作用，可抑制腸道內(nèi)腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖和腐敗產(chǎn)物的產(chǎn)生，乳酸菌被作為飼料添加劑而廣泛應(yīng)用于禽畜養(yǎng)殖中，防治腹瀉、下痢、腸炎等腸道功能紊亂的許多疾病。乳酸菌益生素作為魚、蝦飼料添加劑也受到廣泛的研究，有提高養(yǎng)殖動(dòng)物的免疫力，抵御病原菌的侵襲，提高養(yǎng)殖成活率的效果。體外拮抗實(shí)驗(yàn)是篩選益生菌的重要步驟，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)乳酸菌體外對(duì)致病弧菌的拮抗作用研究，旨在篩選乳酸菌有益菌株，為進(jìn)一步在養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)用益生素產(chǎn)品防治病害提供理論基礎(chǔ)及水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的病害防治提供一種生物防治方法。
作者: cjlittlepig 時(shí)間: 2012-7-21 13:57
1材料與方法
1.1試驗(yàn)菌株
測(cè)試菌：乳酸桿菌L1是經(jīng)點(diǎn)接種法初步篩選出的對(duì)弧菌有拮抗作用的菌株。
指示菌：溶藻弧菌T1是由本所魚病室提供的從患病軍曹魚中分離，并經(jīng)回歸感染確認(rèn)有致病性的菌株。鯊魚弧菌T2也是從患病軍曹魚中分離。
1.2培養(yǎng)基
乳酸菌培養(yǎng)基為改良的MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母膏5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，乙酸鈉3g，檸檬酸三銨2g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g，水1000ml，pH6.8。
弧菌培養(yǎng)基為2216E培養(yǎng)基。
檢測(cè)弧菌培養(yǎng)基為TCBS培養(yǎng)基。
1.3測(cè)定方法
抑菌活性檢測(cè)采用平板打孔抑菌圈測(cè)定法。
平板打孔抑菌圈測(cè)定法：制作2216E培養(yǎng)基，無(wú)菌操作倒平板，每個(gè)平板的培養(yǎng)基厚度為6mm，取指示菌弧菌菌懸液0.1ml，涂布于2216E培養(yǎng)基表面，選擇一定的位置，在無(wú)菌條件下，用無(wú)菌打孔器打孔，孔徑為10mm，將乳酸桿菌發(fā)酵液注入孔內(nèi)（不能溢出），于30℃培養(yǎng)24h，檢測(cè)抑菌圈直徑的大小。以相同pH值的HCl水作對(duì)照。
作者: cjlittlepig 時(shí)間: 2012-7-21 14:00
2結(jié)果
2.1乳酸桿菌及其代謝產(chǎn)物對(duì)弧菌的抑制作用
表1為L1 接種MRS 培養(yǎng)液，經(jīng)24h 培養(yǎng)后的發(fā)酵液及發(fā)酵液經(jīng)5000rpm，15min 離心后取得的上清液，采用平板打孔法測(cè)定抑菌圈的大小。
從表1試驗(yàn)可看出發(fā)酵液與上清液對(duì)指示菌T1、T2 都有抑菌圈，而相同pH值的HCl水卻沒(méi)有，可見(jiàn)發(fā)酵液與上清液的抑菌效果并不是pH值低造成的。試驗(yàn)結(jié)果表明發(fā)酵液比上清液對(duì)弧菌的抑菌圈大，說(shuō)明發(fā)酵液的抑菌活性強(qiáng)于上清液，乳酸桿菌及其代謝產(chǎn)物對(duì)弧菌有協(xié)同抑制作用。發(fā)酵液對(duì)弧菌T1、T2 的抑菌圈大小不同，上清液也是如此，表明L1 發(fā)酵液的代謝產(chǎn)物對(duì)不同種類弧菌的抑菌活性不同。
2.2不同稀釋倍數(shù)發(fā)酵液及離心后上清液的抑菌活性
L1 接種MRS，30℃培養(yǎng)24h，發(fā)酵液用無(wú)菌生理鹽水釋稀1、2、3倍，其稀釋液對(duì)弧菌的抑菌能力見(jiàn)表2。其發(fā)酵液經(jīng)5000rpm，15min 離心，取得上清液，上清液用無(wú)菌生理鹽水釋稀1、2、3倍，其稀釋液對(duì)弧菌的抑菌能力見(jiàn)表3。
從表2、3可看出發(fā)酵液經(jīng)3倍稀釋對(duì)弧菌T1仍有抑制作用，上清液經(jīng)1倍稀釋后對(duì)弧菌T1的抑菌圈大小與發(fā)酵液3倍稀釋液抑菌圈的大小相近。
2.3不同培養(yǎng)時(shí)間發(fā)酵液的抑菌活性
L1接種MRS 培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)，培養(yǎng)18h、24h、36h、48h、72h、5d的發(fā)酵液的抑菌圈大小見(jiàn)表4。
從表4可看出，在菌生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期18h時(shí)的發(fā)酵液對(duì)兩種指示菌都無(wú)抑菌圈，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌圈越來(lái)越大，生長(zhǎng)衰退期（36h）比穩(wěn)定期（24h）的抑菌圈大，5d的陳培養(yǎng)液的抑菌圈最大。原因可能是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸桿菌的生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物抑菌物質(zhì)的積累提高了其殺菌作用；陳培養(yǎng)物和衰退期的發(fā)酵液的抑菌圈大于生長(zhǎng)期及穩(wěn)定期的抑菌圈，可能是一些抗菌活性物質(zhì)在乳酸菌死亡后釋放出來(lái)。
2.4發(fā)酵液抑菌活性物質(zhì)的耐熱性試驗(yàn)
將MRS 24h的發(fā)酵液，于60、80℃恒溫水浴中保溫15min，及沸水浴中保溫5、10、15min，與原發(fā)酵液一起作抑菌活性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。
從表5的試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，發(fā)酵液經(jīng)60、80℃恒溫水浴處理15min，及沸水浴中處理5、10、15min，其抑菌圈大小與未作溫度處理的發(fā)酵液的抑菌圈大小無(wú)差異，可見(jiàn)代謝抑菌物質(zhì)具有很好的耐熱性。對(duì)蝦飼料制作過(guò)程有高溫制粒這一步驟，瞬間溫度可達(dá)100℃，益生菌代謝抑菌物質(zhì)具有良好的耐熱性，可避免對(duì)蝦飼料制作過(guò)程瞬間高溫的破壞，而保持其活性。
作者: cjlittlepig 時(shí)間: 2012-7-21 14:01
作者: cjlittlepig 時(shí)間: 2012-7-21 14:01
3討論
體外抑菌試驗(yàn)是篩選益生菌的手段，通過(guò)L1菌株體外對(duì)弧菌抑制試驗(yàn)，結(jié)果表明L1 菌株對(duì)致病弧菌T1、T2有較強(qiáng)的抑制作用，而且生長(zhǎng)速度快，有望成為微生態(tài)制劑的候選菌種，但能否成為益生菌，還需做一系列的的工作如進(jìn)一步確定其對(duì)宿主有否致病作用，對(duì)被選菌株進(jìn)行致病性評(píng)估；對(duì)宿主潛在效果的評(píng)價(jià)等。
黃滄海等報(bào)導(dǎo)乳酸桿菌的代謝產(chǎn)物對(duì)不同血清型的大腸桿菌的抑制作用存在一定的差別，本試驗(yàn)的結(jié)果也表明，乳酸桿菌L1 對(duì)不同的弧菌有不同的抑菌活性。水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物不同的疾病因病原不同，因此，實(shí)際在應(yīng)用益生素制劑時(shí)，如果沒(méi)有了解清楚益生菌的適用對(duì)象和范圍就可能就會(huì)有不同的效果。Gatesoupe（1999）［8］通過(guò)每天添加乳桿菌在大菱鲆幼體活體食物的輪蟲的培養(yǎng)基中，大大提高了魚的成活率，當(dāng)病原性弧菌侵襲幼體時(shí)，添加的乳桿菌能夠大大降低幼體在9d前的死亡率。因此認(rèn)為乳桿菌可以防御病原菌-弧菌入侵大比目魚的幼體。而Gildberg等（1997）［9,10］用添加了產(chǎn)乳酸細(xì)菌的飼料喂養(yǎng)大西洋鱈，將它們與經(jīng)腹膜內(nèi)感染了氣單胞菌的魚苗一起養(yǎng)殖，在以后4周時(shí)間內(nèi)記錄魚的死亡率，結(jié)果表明產(chǎn)乳酸細(xì)菌作為魚苗飼料的添加成分可以促進(jìn)腸微生物的定植，但未出現(xiàn)防止氣單胞菌感染的現(xiàn)象，與預(yù)想相反，在飼料中添加了產(chǎn)乳酸細(xì)菌的魚苗的死亡率最高。
本試驗(yàn)的結(jié)果表明乳酸桿菌與代謝產(chǎn)物有協(xié)同抑菌作用。因此在評(píng)價(jià)乳酸菌的抑菌效果時(shí)，以乳酸桿菌與代謝產(chǎn)物的協(xié)同抑菌效果作為衡量指標(biāo)應(yīng)當(dāng)是更科學(xué)合理。在使用乳酸菌益生素產(chǎn)品時(shí)，不應(yīng)當(dāng)只是利用其菌體，菌體及其代謝產(chǎn)物能一起使用效果可能會(huì)更好。
作者: 匪兵從良 時(shí)間: 2012-7-21 15:59
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作者: 逆游的魚 時(shí)間: 2012-7-21 17:36
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作者: 逆游的魚 時(shí)間: 2012-7-23 11:32
逆游的魚 發(fā)表于 2012-7-21 17:36 
嗯嗯
作者: apldwf 時(shí)間: 2013-7-22 12:33
{:soso_e142:}
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