乳酸桿菌L1對致病弧菌的抑制作用

cjlittlepig

摘自《南方水產》

摘要：以致病弧菌T1、T2為檢測菌，采用平板抑菌圈檢測法，研究乳酸桿菌L1及其代謝產物的抑菌能力。結果表明：L1發酵上清液對兩種弧菌的抑制效果和發酵液對弧菌的抑菌作用相似，即對弧菌T1 的抑制作用強于T2；L1發酵液對弧菌T1、T2的抑制能力強于上清液，表明乳酸桿菌及其代謝物質對弧菌具有協同抑制作用；L1的發酵液經3倍稀釋仍對弧菌T1 有抑制作用；乳酸桿菌L1生長不同時期的代謝產物對弧菌的抑菌活性不同，代謝產物的抑菌能力在衰退期＞ 穩定期＞ 生長期；L1的發酵液經沸水浴處理15min其抑菌活性不變，表明抑菌代謝物質具有較好的耐熱性。  

關鍵詞：乳酸桿菌；弧菌；抑菌能力

cjlittlepig

    弧菌廣泛存在于養殖水體，是海水養殖動物的主要病原菌，弧菌病是目前為止對養殖魚蝦危害最大，造成損失最嚴重的細菌性疾病之一。弧菌病可以發生在養殖的各個時期，因此防治對蝦弧菌病是養殖成敗的關鍵因素。防治細菌性疾病最常用的方法是使用抗菌素，但頻繁無節制的使用藥物，導致耐藥性菌株的產生并且造成環境的污染，因此，抗菌素的有效替代品的研究顯得尤為迫切，應用生物及生態法防治疾病日益受到重視。大量的研究表明［1-7］，乳酸菌能夠調節機體腸道正常菌群，保持微生態平衡，提高食物消化率和生物價，增強機體的免疫功能，提高機體的抗病能力，產生抑菌活性代謝產物，如乳酸菌肽、細菌素、乳酸、過氧化氫、乙酸等，對許多革蘭氏陽性菌李斯特氏菌、芽孢菌、梭菌等及革蘭氏陰性菌大腸桿菌等有強烈的抑制作用，可抑制腸道內腐敗菌的生長繁殖和腐敗產物的產生，乳酸菌被作為飼料添加劑而廣泛應用于禽畜養殖中，防治腹瀉、下痢、腸炎等腸道功能紊亂的許多疾病。乳酸菌益生素作為魚、蝦飼料添加劑也受到廣泛的研究，有提高養殖動物的免疫力，抵御病原菌的侵襲，提高養殖成活率的效果。體外拮抗實驗是篩選益生菌的重要步驟，本實驗通過乳酸菌體外對致病弧菌的拮抗作用研究，旨在篩選乳酸菌有益菌株，為進一步在養殖生產中應用益生素產品防治病害提供理論基礎及水產養殖動物的病害防治提供一種生物防治方法。

cjlittlepig

1材料與方法

1.1試驗菌株

    測試菌：乳酸桿菌L1是經點接種法初步篩選出的對弧菌有拮抗作用的菌株。

    指示菌：溶藻弧菌T1是由本所魚病室提供的從患病軍曹魚中分離，并經回歸感染確認有致病性的菌株。鯊魚弧菌T2也是從患病軍曹魚中分離。

1.2培養基

    乳酸菌培養基為改良的MRS培養基：蛋白胨10g，酵母膏5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，乙酸鈉3g，檸檬酸三銨2g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g，水1000ml，pH6.8。

    弧菌培養基為2216E培養基。

    檢測弧菌培養基為TCBS培養基。

1.3測定方法

    抑菌活性檢測采用平板打孔抑菌圈測定法。

    平板打孔抑菌圈測定法：制作2216E培養基，無菌操作倒平板，每個平板的培養基厚度為6mm，取指示菌弧菌菌懸液0.1ml，涂布于2216E培養基表面，選擇一定的位置，在無菌條件下，用無菌打孔器打孔，孔徑為10mm，將乳酸桿菌發酵液注入孔內（不能溢出），于30℃培養24h，檢測抑菌圈直徑的大小。以相同pH值的HCl水作對照。

cjlittlepig

2結果

2.1乳酸桿菌及其代謝產物對弧菌的抑制作用
    表1為L1 接種MRS 培養液，經24h 培養后的發酵液及發酵液經5000rpm，15min 離心后取得的上清液，采用平板打孔法測定抑菌圈的大小。
    從表1試驗可看出發酵液與上清液對指示菌T1、T2 都有抑菌圈，而相同pH值的HCl水卻沒有，可見發酵液與上清液的抑菌效果并不是pH值低造成的。試驗結果表明發酵液比上清液對弧菌的抑菌圈大，說明發酵液的抑菌活性強于上清液，乳酸桿菌及其代謝產物對弧菌有協同抑制作用。發酵液對弧菌T1、T2 的抑菌圈大小不同，上清液也是如此，表明L1 發酵液的代謝產物對不同種類弧菌的抑菌活性不同。

2.2不同稀釋倍數發酵液及離心后上清液的抑菌活性
        L1 接種MRS，30℃培養24h，發酵液用無菌生理鹽水釋稀1、2、3倍，其稀釋液對弧菌的抑菌能力見表2。其發酵液經5000rpm，15min 離心，取得上清液，上清液用無菌生理鹽水釋稀1、2、3倍，其稀釋液對弧菌的抑菌能力見表3。
    從表2、3可看出發酵液經3倍稀釋對弧菌T1仍有抑制作用，上清液經1倍稀釋后對弧菌T1的抑菌圈大小與發酵液3倍稀釋液抑菌圈的大小相近。

2.3不同培養時間發酵液的抑菌活性
        L1接種MRS 培養基，30℃培養，培養18h、24h、36h、48h、72h、5d的發酵液的抑菌圈大小見表4。
    從表4可看出，在菌生長的對數期18h時的發酵液對兩種指示菌都無抑菌圈，隨培養時間的延長，抑菌圈越來越大，生長衰退期（36h）比穩定期（24h）的抑菌圈大，5d的陳培養液的抑菌圈最大。原因可能是隨著培養時間的延長，乳酸桿菌的生長及代謝產物抑菌物質的積累提高了其殺菌作用；陳培養物和衰退期的發酵液的抑菌圈大于生長期及穩定期的抑菌圈，可能是一些抗菌活性物質在乳酸菌死亡后釋放出來。

2.4發酵液抑菌活性物質的耐熱性試驗
    將MRS 24h的發酵液，于60、80℃恒溫水浴中保溫15min，及沸水浴中保溫5、10、15min，與原發酵液一起作抑菌活性試驗，試驗結果見表5。
    從表5的試驗結果可見，發酵液經60、80℃恒溫水浴處理15min，及沸水浴中處理5、10、15min，其抑菌圈大小與未作溫度處理的發酵液的抑菌圈大小無差異，可見代謝抑菌物質具有很好的耐熱性。對蝦飼料制作過程有高溫制粒這一步驟，瞬間溫度可達100℃，益生菌代謝抑菌物質具有良好的耐熱性，可避免對蝦飼料制作過程瞬間高溫的破壞，而保持其活性。

cjlittlepig

cjlittlepig

3討論
    體外抑菌試驗是篩選益生菌的手段，通過L1菌株體外對弧菌抑制試驗，結果表明L1 菌株對致病弧菌T1、T2有較強的抑制作用，而且生長速度快，有望成為微生態制劑的候選菌種，但能否成為益生菌，還需做一系列的的工作如進一步確定其對宿主有否致病作用，對被選菌株進行致病性評估；對宿主潛在效果的評價等。
    黃滄海等報導乳酸桿菌的代謝產物對不同血清型的大腸桿菌的抑制作用存在一定的差別，本試驗的結果也表明，乳酸桿菌L1 對不同的弧菌有不同的抑菌活性。水產養殖動物不同的疾病因病原不同，因此，實際在應用益生素制劑時，如果沒有了解清楚益生菌的適用對象和范圍就可能就會有不同的效果。Gatesoupe（1999）［8］通過每天添加乳桿菌在大菱鲆幼體活體食物的輪蟲的培養基中，大大提高了魚的成活率，當病原性弧菌侵襲幼體時，添加的乳桿菌能夠大大降低幼體在9d前的死亡率。因此認為乳桿菌可以防御病原菌-弧菌入侵大比目魚的幼體。而Gildberg等（1997）［9,10］用添加了產乳酸細菌的飼料喂養大西洋鱈，將它們與經腹膜內感染了氣單胞菌的魚苗一起養殖，在以后4周時間內記錄魚的死亡率，結果表明產乳酸細菌作為魚苗飼料的添加成分可以促進腸微生物的定植，但未出現防止氣單胞菌感染的現象，與預想相反，在飼料中添加了產乳酸細菌的魚苗的死亡率最高。
    本試驗的結果表明乳酸桿菌與代謝產物有協同抑菌作用。因此在評價乳酸菌的抑菌效果時，以乳酸桿菌與代謝產物的協同抑菌效果作為衡量指標應當是更科學合理。在使用乳酸菌益生素產品時，不應當只是利用其菌體，菌體及其代謝產物能一起使用效果可能會更好。

匪兵從良

{:soso_e142:}{:soso_e142:}{:soso_e142:}

逆游的魚

{:soso_e183:}{:soso_e142:}

逆游的魚

逆游的魚 發表于 2012-7-21 17:36

嗯嗯

apldwf

{:soso_e142:}