人工飼料飼養的對蝦腸道菌群和水體細菌區系的研究

cjlittlepig

摘自《熱帶海洋學報》

摘要: 對人工飼料飼養的凡納濱對蝦成蝦腸道菌群組成及其水體細菌區系組成進行了研究。分離純化后的革蘭氏陰性菌鑒定到種的水平。對蝦腸道菌群主要由弧菌、希瓦氏菌屬、嗜氫菌屬、伯克霍爾德氏菌、氣單胞菌、食酸菌和芽孢桿菌組成。水體細菌區系主要包括弧菌、希瓦氏菌屬、艾肯菌、無色桿菌和芽孢桿菌。腸道菌群和水體細菌區系的優勢菌是副溶血弧菌和芽孢桿菌。利用Shannon-Wiener 指數進行多樣性分析，發現蝦腸道多樣性指數(H ) 和均勻度( J ) 高于水體細菌區系，而豐度( D) 較低。

關鍵詞: 蝦腸道菌群; 水體細菌區系

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用微生態學方法來防治病害發生、減少環境污染、增進動物健康是未來水產養殖業的熱點。腸道菌群是微生態學中的一個重要組成部分。腸道菌群對其他動物包括魚蝦類的生長、存活有重要的生理意義[1] 。本文使用Biolog[2]方法對凡納濱對蝦成蝦腸道細菌區系組成及其水體細菌區系組成進行了研究，目的在于為對蝦腸道菌群研究提供一些基礎數據。

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1 材料與方法

1.1試驗用蝦及飼養管理

凡納濱對蝦蝦苗購于中國水產科學研究院南海水產研究所海南開發中心，體重為0.827±0.006g。蝦苗置于14 個容積為250L 的水池中養殖，每個水池飼養對蝦25 尾。本試驗為全封閉式循環養殖系統，養殖水體為砂濾循環人工海水。每天早、中、晚各投喂1 次，飼料為添加了芽孢桿菌制劑的對蝦飼料( 中國水產科學研究院南海水產研究所生產) 。試驗期間水的鹽度為7-11，溫度為28-31℃。飼喂56d 后對蝦平均體重為7.91±0.75g，成活率為95% ±1%。

1.2腸道細菌分離和計數

蝦苗飼養56d 后隨機在一個水池中取14 尾，蝦表面用75% 酒精消毒，在無菌操作下取出整條腸道，加入事先稱重過的已滅菌的玻璃勻漿器中稱重。加入少量無菌生理鹽水( 0.85% NaCl) 進行勻漿，勻漿后定容至1ml。以勻漿后的樣品為原液進行10 倍梯度稀釋，取0.1ml 涂布2216E 平板，28 ℃倒置培養2d 后進行活菌計數。分離純化2216E 平板上的單菌落，菌種保存于- 70℃冰箱中。

1.3水體細菌分離和計數

現場用無菌玻璃瓶采集水樣500ml 密封帶回實驗室，然后取1ml 進行10 倍梯度稀釋，取01 1ml 涂布2216E 平板，28 ℃倒置培養2d 后進行活菌計數。隨機挑取2216E 平板上各種單菌落劃線作進一步純化。菌種保存于- 70 ℃冰箱中。

1.4 Biolg 方法鑒定分析純菌株

按照Biolog( ML3 _ 420) 快速鑒定系統操作程序，對純菌株進行革蘭氏染色后將革蘭氏陰性細菌按照傳統方法[3] 進行氧化酶生化鑒定和三糖鐵試驗，對其進行分類。革蘭氏陽性菌按照Shewan 的海洋異養細菌檢索表檢索[4]。各類不同的革蘭氏陰性菌培養于Biolog 培養基，根據不同的濁度要求制備菌懸液，用多孔加樣器接種于96孔GN 微板，每孔150μL，置于合適培養溫度下培4h、16h 后觀察結果。根據微板純細菌代謝指紋情況和Biolog數據庫相似度以及位距，得出鑒定結果(表1)。相似度在0.500-1.000之間，位距在0-5.00 之間，是比較滿意的結果。

1.5 細菌多樣性的分析

根據生態學原理，按種的水平分析對蝦腸道細菌區系(P) 和水體細菌區系(W) 的多樣性，分別用Shannon-Wiener 多樣性指數( H ) 、豐度( D) 和均勻度( J ) [4] 表示。計算公式如下:

H = -∑Pi log2 P 1

D = ( S - 1) / log2N

J = H / log2S

式中Pi 為i 種的個數與樣品中總個數的比值，S為采樣點中樣品的總種類數，N 為樣品中細菌的總數。

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2 結 果

2.1 鑒定結果

純化菌株鑒定結果見表1。從對蝦腸道菌群和水體細菌區系中共分離出71 株細菌，其中7 株革蘭氏陰性菌因為不在Biolog系統數據庫中或者是因為在移種、保種過程中死亡而沒有結果。對蝦腸道菌群主要由弧菌、希瓦氏菌屬、嗜氫菌屬、伯克霍爾德氏菌、氣單胞菌、食酸菌和芽孢桿菌組成。水體細菌區系主要包括弧菌、希瓦氏菌屬、艾肯菌、無色桿菌和芽孢桿菌。

2.2 細菌計數結果以及優勢種組成

對蝦腸道菌群和水體細菌區系的異養細菌總數以及優勢種組成見表2。

2.3 細菌聚類分析

對蝦腸道革蘭氏陰性菌和水體革蘭氏陰性菌在24h 記錄的對95種碳源利用的OD 值作為統計標量，利用Biolog系統的Mlclust 程序進行聚類分析。結果表明，對蝦腸道菌群與水體細菌區系菌株之間的相似性達到70% 以上，兩者優勢菌的相似度高達90%以上(圖1) 。

2.4 細菌多樣性

把未鑒定出來的菌株當成一個類群后，分析了對蝦腸道菌群和水體細菌區系的細菌多樣性指數(表3) 。

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3 討 論

已有研究結果表明，對蝦的腸道菌群組成受外部環境影響較大，但弧菌是其腸道常見細菌。Moriaty[ 6] 發現在Penaeus japonicus 的養殖水體和腸道中具有相同的細菌類群。Yasuda 等[7] 報道，在日本對蝦的蚤狀幼體期弧菌是優勢菌屬，養殖126d 以后蝦池中的優勢菌是弧菌，但是在沉積物中假單胞菌是優勢菌，而日本對蝦的成蝦棲息在沉積物中，因此認為在日本對蝦成蝦消化道中的優勢菌是假單胞菌。Dempsey等[8] 報道了在對蝦Penaeus aztecus 和Penaeus setiferus 的胃和后腸中分離鑒定出5 類占優勢的細菌類群，它們是弧菌、產堿桿菌、氣單胞菌、色桿菌和類假單胞菌( 假單胞菌、黃單胞菌和交替單胞菌) 。Wang 等[9]報道了野生健康中國對蝦腸道細菌區系優勢菌屬為弧菌和發光桿菌屬。從本實驗結果看，蝦腸道和養殖水體具有相同的優勢菌(表2) ; 從細菌組成看，蝦腸道可培養的細菌種類比養殖水體多，對蝦腸道中存在部分細菌種類而養殖水體沒有(表1) 。這表明對蝦腸道菌群與養殖水體有關，也與飼料有關。在外部環境中少量存在的細菌進入對蝦腸道后可以大量繁殖。

在養殖環境中微生物主要充當“消費者”的角色，起著分解動植物殘體、儲存轉化養分、降解污染物等作用，從而使得水域環境得到凈化; 但有害細菌的增長會導致病害的發生。通常條件致病菌是海水中的常見菌，有可能隨海水進入養殖池中。在人工高密度養殖過程中各種人為因素如水處理過程( 化學試劑和UV 處理) 會干擾水體中的正常細菌區系，加上高密度的養殖、死亡動物以及活餌料的投喂造成高負荷的有機環境，促使池中有害細菌大量生長繁殖。弧菌被報道是對蝦的條件致病菌[10] 。

從碳源利用量來看，弧菌可以利用的碳源多達44種，一旦蝦池環境受到污染，弧菌就能優先利用有機物而進行增殖，若弧菌的增長抑制了其他細菌的生長，整個微生態平衡受到脅迫，生態功能下降甚至喪失，其蝦池物質循環受到抑制。同時，當水體中弧菌占據最大優勢時對蝦腸道中也應該存在大量弧菌，對蝦受到弧菌的攻擊，生長受到抑制、免疫力低下[11]，再加上外部環境的脅迫就容易發病甚至死亡。可見病害的發生不是特定病原菌引起的，而是環境污染、對蝦抵抗力弱、微生態多樣性減少的綜合結果。本試驗中弧菌數量較多并占據優勢地位，但是其細菌多樣性指數也較高，同時芽孢桿菌的存在可能以某種機制刺激了對蝦的免疫機能[12]防御弧菌病原菌的攻擊，因此并沒有爆發病害。

從碳源利用量來看，對蝦腸道細菌在純培養時具有較大的碳源代謝能力。這可能表明對蝦腸道中的細菌區系與高等陸生動物腸道中細菌區系一樣參與了機體的消化過程，它們在對蝦的腸道中能夠以高密度存在，并且在相對短但營養豐富的腸道中具有非常大的消化活性。Wang 等[9] 研究也表明，對蝦腸道中某些弧菌很可能具有潛在的助消化能力。

在全封閉式養殖模式下，水體細菌區系相對來說與殘餌的關系更為密切。在本研究中，整個對蝦腸道中弧菌和芽孢桿菌是優勢菌，與水體中的優勢菌組成一致。對蝦腸道菌群受水體以及餌料的影響較大。弧菌包括對蝦條件致病菌，不僅是蝦池水體中的正常菌群，還可以在對蝦腸道中大量繁殖，可能具有潛在的助消化能力。可以進一步研究從弧菌中篩選有益菌再混合其他有益菌制成一個多功能群的微小區系應用于水產養殖中，利用弧菌的適合蝦池環境生長的有利條件來進行微生態調節，化有害為有利，從而達到改善整個養殖生態環境的效果。

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