對蝦腸胞蟲病 (EHP) 的新管理方法

一片云

　　針對對蝦腸胞蟲病的新管理方法


　　隨著微孢子寄生蟲的出現，對蝦腸孢蟲�。‥HP）使得世界各地蝦農產量損失嚴重。本文描述的最新的檢測方法和管理方法對應對該疾病將起到關鍵作用。

　　不同種類的微孢子蟲會對對蝦的肌肉組織，心臟，性腺，鰓，肝胰臟，和神經節產生感染。對蝦微孢子蟲被視為對蝦群體一個潛在威脅，并且會對水產養殖業的經濟效益造成影響。近期，一種叫對蝦腸胞蟲病(EHP)的微孢子被發現存在于對蝦的肝胰腺中的小管上皮細胞的細胞質中。在一些東南亞國家，例如越南，泰國，馬來西亞，印度尼西亞，中國和印度的對蝦養殖場已經相繼發現此類微孢子的存在。對蝦腸胞蟲病(EHP)的臨床癥狀還未具體化，但已發現與對蝦發育遲緩有關聯。

　　對蝦腸孢蟲病(EHP)的組織病理學

　　在檢查被對蝦腸孢蟲病（EHP）感染的來自越南的南美白對蝦（2014）樣本中發現肝胰腺小管上皮細胞的細胞質中存在嗜堿細胞內含物（圖1A&1B）。 在這實驗中，孢蟲呈現出原形體階段,成熟嗜堿性的孢子也被檢測到。被對蝦腸孢蟲病（EHP）感染的來自文萊的藍對蝦（2006）也發現微孢子蟲存在于肝胰腺（圖1C）。這些結果顯示對蝦腸孢蟲�。‥HP）早在2006年就存在在亞洲。

　　對蝦腸孢蟲病的聚合酶鏈反應

　　

　　圖1：對蝦腸孢蟲病(EHP)組織病理學顯現在感染的對蝦上。（A&B）南美白對蝦的肝臟胰組織，（C）藍對蝦。箭頭代表成熟的孢子；星星代表原形體階段。（比例=25μm.）

　　我們選擇用來檢測對蝦腸孢蟲�。‥HP）的染色體底物包括EHP-510F (5’-GCCTGAGAGATGGCTCCCACG) 和 EHP-510R (5’-GCGTACTATCCCCAGAGCCCG)。用已經受感染的對蝦DNA提取物實施聚合酶鏈反應（PCR）。結果顯示這個聚合酶鏈反應能夠檢測出已受感染的對蝦（圖2，1-3行）；染病對蝦的排泄物以及水質樣本均被檢測出感染對蝦腸孢蟲（EHP）（圖2，4-5行）。同時我們也檢測了另外兩種寄生蟲病原體：阿米巴蟲和蝦白肉病微孢子蟲，然而這些對蝦腸孢蟲�。‥HP）底物并沒有與該兩種病蟲發生交叉反應（圖2，6-7行）。

　　
　　圖 2. 對蝦腸孢蟲病毒聚合酶鏈反應（PCR）檢測對蝦腸孢蟲病毒（EHP）。M: 1 kb以上的階梯型分子量標準。 從越南收集來的南美白對蝦樣本（第一行，2014年樣本；第二行，2015年樣本）和來自泰國（3-5行，無特定病原體對蝦，排泄物和水），感染白肉病的斑節對蝦（第六行），感染阿米巴蟲的南美白對蝦（第七行），無特定病原體的南美白對蝦（第八行），鹵蟲生物樣本（第九行），無操作對照組（第十行）。

　　令人意外的是，我們從4/9的冷凍鹵蟲生物樣本中檢測出對蝦腸孢蟲病(EHP)（圖2，9行，一個非常具有代表性的樣本）。在這些對對蝦腸孢蟲病(EHP)呈陽性的樣本中，18S rRNA基因被擴充和重新排列。這個被修改的序列與來自越南的對蝦腸孢蟲病樣本有99.9%的相似，也就是說鹵蟲中所帶有的對蝦腸孢蟲病毒(EHP)很可能源自東南亞。

　　對蝦腸孢蟲病傳播的研究

　　以上三個生物測定均使用來自泰國的已感染對蝦腸孢蟲病的對蝦樣本。在第一個生物測定（共棲組）中，染病對蝦被轉移到實驗缸中與用高彈體標記的無特定病原體的對蝦一起生活。35天后，無特定病原體的對蝦感染對蝦腸孢蟲病毒（圖3A）。在第二個生物測定（水生感染組）中，用曾飼養過染病對蝦的水體轉移到無特定病原體的對蝦實驗缸中。42天以后，無特定病原體的對蝦依舊沒有感染病毒（圖3A）。在第三個生物測定中，用染病對蝦的肝胰腺喂養無特定病原體的對蝦，每隔五天用聚合酶鏈反應（PCR）分析樣本；15天后，無特定病原體的對蝦感染病毒（圖3B）。實驗結果顯示，對蝦腸孢蟲病毒（EHP）可以通過嗜食同類傳播。
　　
　　圖3：聚合酶鏈反應生物檢測1，生物檢測2，以及生物檢測3的肝胰腺樣本。（A）35天后檢測出共棲組存在EHP，但是不能檢測到水生感染組。（B）15天后，EHP在（嗜食同類）被檢測到。

　　原位雜交（ISH）

　　通過用地高辛標記法標記的對蝦腸孢蟲病進行原位雜交，染病的南美白對蝦（圖4A）和藍對蝦（圖4B）顯示微孢子（嗜堿性的內含物）存在于肝胰腺小管的上皮細胞中。實驗中的探針具有非常高的識別敏銳性，在已感染蝦白肉病的斑節對蝦中，該探針無任何反應顯示（圖4C）。
　　
　　圖4. 用地高辛標記法標記的對蝦腸孢蟲病(EHP)探針在對連續部位進行原位雜交。深藍色沉淀物表示對蝦腸孢蟲病(EHP)的出現（A）用對蝦腸孢蟲病(EHP)探針對南美白對蝦（越南）進行原位雜交；（B）藍對蝦（文萊）；（C）斑節對蝦表現出了白肉病癥狀（馬達加斯加），插入圖片（D）：使用Perezia penaei探針的原位雜交。比例條＝25 μm。

　　結語

　　對蝦腸孢蟲病(EHP)在養殖對蝦中的傳播可能還會繼續，需要通過建立有效的方法來監控這種寄生蟲的發病和傳播。所以通過用敏銳的分子生物學方法去檢測對蝦，活餌料和蝦塘環境的對蝦腸孢蟲病(EHP)會非常有效。感染對蝦腸孢蟲病(EHP）的對蝦通常不能被肉眼識別，因為EHP不會呈現臨床癥狀。本研究表明基于聚合酶鏈反應（PCR）和原位雜交（ISH）的檢測方法和診斷步驟具有具體性和靈敏性，可作為有效的常規診斷方法去檢測對蝦養殖群體，池塘環境和對蝦產品。

文章來源于This article was originally published on the Advocate in English on April 15, 2016.

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0928 發表于 2016-7-24 00:11
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