原創技術貼之四-自己擴培發酵活菌的誤區

horsegreenhill

自己擴培發酵活菌的誤區

中國海洋大學 水產微生物

馬青山博士

       受到病害、臺風及價格行情等因素的影響，今年水產養殖行業有些慘淡。養殖戶通過多種方式控制成本，而自行擴培發酵活菌就是其中之一。不少養殖戶自己搗鼓發酵，也有挺多這種形式的套裝產品，但我發現在擴培的過程中存在挺多的誤區和問題。下面就同大家進行分享：

1、  關于擴培的菌種

       所使用微生物種類：

       我在下面轉市場發現，現在好像什么菌種養殖戶都能擴培、什么菌種的產品擴培套餐都有，EM、芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌、光合細菌都全乎了。但我只推薦大家自己擴培乳酸菌、光合細菌，為什么呢？首先大家要注意，自己擴培最重要的是不能染雜菌！而乳酸菌兼性厭氧，并且擴培好的pH在4-5左右，一般雜菌難以生長；而光合細菌厭氧擴培，且培養基組分相對缺乏營養，也不易染雜菌。

      下圖是養殖戶自己擴培的乳酸菌，密封發酵，擴培20h，擴培出來發酵液的活菌數我也跟著測了，有10⁸cfu/ml，基本沒有雜菌。所以說，厭氧密封的條件下，擴培還是比較容易成功的。

file:///C:/Users/DBN-PR~1/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image002.jpg

       不過，像EM、芽孢桿菌等，它們是需氧菌，也就是說你擴培的時候要敞著蓋，某些產品說明書里還讓大家通氣、攪拌，這不就相當于接種雜菌么？另外，這兩種菌擴培的pH在7左右，一般雜菌都能生長，整不好就擴培出有致病性的微生物，所以不建議自己擴培，不過大家倒是可以在使用前加點紅糖，活化個2-4個小時潑灑，既不染菌，又增強了芽孢桿菌的活力。

       下圖是養殖戶自己擴培的EM菌，大家可以看到其表面漂浮一層厚厚的白膜，這層白膜主要由需氧菌組成，理想的情況下是一些枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌，這樣用起來倒是沒什么壞處；但也不排除可能是某些致病需氧菌，那就比較麻煩了。所以自己擴培需氧菌，風險還是比較高的。

file:///C:/Users/DBN-PR~1/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image004.jpg

菌種可用代數：

       除光合細菌外，其他自己擴培的活菌不建議留種，原因有二：1、易染雜菌；2、菌種活力欠佳。而光合細菌菌種擴培最好控制在4代以內，4代以上，菌種活力明顯下降。

2、  關于擴培的培養基

       擴培的培養基一般有兩個來源，一個是養殖戶自己配制的，另一個是產品套裝里帶的，但不管是哪一種，都離不開一股子糖蜜味，為啥？1、糖蜜便宜；2、糖蜜提供碳源；3、擴培的發酵液一股香甜的糖蜜味，養殖戶感覺味道好。但真正的擴培培養基是不加糖蜜的，大家可以看看下面的培養基：

實驗室擴培芽孢桿菌、EM菌：

       胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，配制1L培養基；

實驗室擴培乳酸菌：

       酪蛋白胨 10g、 酵母提取液 5g、葡萄糖 5g、乙酸鈉 5g，配制1L培養基；

       這種培養基可以迅速讓微生物擴培生長，且營養均衡，能夠達到較高的活菌數，但相對來講會比糖蜜為主的培養基貴，不過，若大家直接去淘寶買大包裝，也能便宜不少。

3、  關于擴培的方法

   之前已經提到，微生物擴培發酵最需要注意的地方就是要嚴格控制雜菌的污染，而這里提到的擴培方法也主要是這方面的一些注意事項。

（1）      擴培活菌所用的桶、盆等容器最好消消毒，所用的水最好加熱滅下菌。

（2）      不同微生物有自己適合生長的溫度，一般而言，擴培建議在25攝氏度左右，比較適合現在應用較多的乳酸菌、芽孢桿菌等的生長。

（3）      為了防止污染，乳酸菌、光合細菌密封發酵，發酵期間不要攪拌；EM、芽孢桿菌等需氧菌發酵過程需要攪拌的，建議每桶配一根棍子，防止交叉污染。

（4）      每次取用后要嚴格密封放在陰涼遮陽處存放，需要長時間保存最好分裝在小容器中。

4、  擴培終點的判斷

       不同的菌種，擴培終點的判斷方法有所不同。一般而言，養殖戶主要通過聞味道對發酵終點進行判斷，除某些光合細菌外，擴培出來的發酵液味道以酸香味、酵香味為主，出現餿味、腐敗味道，可能污染雜菌，建議不要使用。

       除了聞味道，養殖戶也可以自己測測pH值，像乳酸菌發酵終點pH值一般為4-5左右，芽孢桿菌、EM、光合細菌pH值一般為7-8左右。

       最后，有條件的養殖戶最好能用顯微鏡鏡檢一下，40物鏡×10目鏡即可清晰看到乳酸菌、芽孢桿菌等微生物，取發酵液自己看看，到底有多少微生物，是球的，還是桿的，等等。總之，有了顯微鏡可以更好地判斷發酵好壞及發酵終點，具體方法就不在這里展開了，有需要的可以直接聯系我詳聊（QQ：416063411）。

注：此文屬個人原創，謝絕轉載！

漁歌子

感謝馬博士的分享！

濤家強

感謝樓主的分享！

horsegreenhill

不客氣，有問題可以直接交流！

jinlimin1

請教400倍顯微鏡怎么看乳酸菌、芽孢桿菌等微生物？

蟹將

的確是博士級別的 但是這個培養配方不適合養殖戶，而且自己培養EM菌 pH 可以低到3.2-3.5，菌數量級達到十億。

蟹將

這篇文章可能有一些不妥的地方 ，提提意見

1. 乳酸菌發酵時間才20h,就來進行質量評價，不科學，起碼發酵96小時以上再評價比較妥當

2. 實驗室擴培芽孢桿菌、EM菌：
  胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，配制1L培養基； 這個配方是經典的培養大腸桿菌的配方，但是拿來發酵培養芽孢桿菌，EM菌，是不是有點太兒戲了，大量的碳源在哪兒？

3、第二個配方里面用到了葡萄糖，以前養殖戶都喜歡往水里潑葡萄糖，現在基本很少了，為什么？很多人認為是弧菌比較喜歡吃單糖，潑到水里培養弧菌了。現在養殖戶培養乳酸菌、EM菌愛用紅糖，跑塘口多的話，這個不得不提。

4. 現在大部分EM菌還是采取厭氧發酵的，不需要攪拌需要密封，最終成品pH 在3-3.5，如果是7-8看誰敢用。（另外現在水產上售賣的EM菌，其實是大多數是以乳原來酸菌、酵母菌、等一些菌復配出來的，原來傳統說法80多種菌的EM菌只是一個傳說）

5。顯微鏡下，除非酵母菌、糞鏈球菌之類的特殊形態菌，在400倍下想區分是乳酸菌還是什么其他雜菌，還是洗洗睡吧，但是如果有顯微鏡，看見很多菌，而且pH也很低，那基本上發酵是成功了。所以測量pH是發酵乳酸菌 EM菌的最簡單方法，低于3.5即可

只是探討，水產行業需要多種聲音，我說的也不一定是對的，只是因為實踐過，所以說說意見。

vanadis

自己擴培益生菌的技術門檻并不是太高，就是就點麻煩，其次 是生產上和使用時間對不上號。像一些常規益生菌完全可以用自己擴培，比如乳酸菌，光合菌

horsegreenhill

蟹將 發表于 2016-4-8 10:21
這篇文章可能有一些不妥的地方 ，提提意見

1. 乳酸菌發酵時間才20h,就來進行質量評價，不科學，起碼發酵 ...

非常感謝您的回復，有不同聲音、有爭論、有交流才會進步。我也對您提出的意見進行逐一回復：

1、其實菌種擴培所需要的時間同菌種、培養基及所處的環境關系非常大，您說的96小時是不是溫度較低？用的糖蜜等緩釋碳源？如果菌種活力足夠，培養基營養充分，且溫度30攝氏度左右，20小時是可以完成擴培的。

2、沒錯，這確實是經典的LB培養基，培養大腸桿菌、芽孢桿菌都沒有問題的。其中胰蛋白胨既可以提供氮源，又可以提供碳源。
3、我這里提到的是養殖戶自己擴培菌，并不是潑灑葡萄糖，潑灑葡萄糖那確實是非常危險的。擴培的過程中，如果用葡萄糖作為碳源，其效率遠高于糖蜜，這也說明了為什么我之前20小時左右就能發酵好，但一定要把握好擴培火候與雜菌控制。

4、這點我非常贊同，以乳酸菌為主的EM還是比較靠譜的，不然擴培染菌風險較高。

5、文章中所提為：通過顯微鏡的觀察能夠區分球菌、桿菌、鏈球菌，及大概判斷下菌數目多少，酵母菌大概比常見細菌大10倍左右，400倍放大觀察這些內容是沒有問題的。但觀察細菌需要用結晶紫進行染色，如果想了解這方面的知識，咱們可以詳聊。下面我附幾張400倍放大的芽孢桿菌、乳酸菌圖片。對于咱們養殖戶，通過pH來判斷發酵是否成功確實是個好辦法，顯微鏡的觀察可能需要比較專業的培訓。

下圖是巨大芽孢桿菌，透明小體為芽孢（10*40，結晶紫染色）

下圖是乳酸鏈球菌，能夠觀察到呈鏈狀的球形菌（10*40，結晶紫染色）

再次感謝您的回復，希望咱們能夠多多交流，共同進步！

horsegreenhill

jinlimin1 發表于 2016-4-8 09:15
請教400倍顯微鏡怎么看乳酸菌、芽孢桿菌等微生物？

需要通過結晶紫染色即可觀察，可查看下面回復，有相關照片。

蟹將

vanadis 發表于 2016-4-8 14:09
自己擴培益生菌的技術門檻并不是太高，就是就點麻煩，其次 是生產上和使用時間對不上號。像一些常規益生菌完 ...

是的，如果能趕上擴培和使用周期 相當經濟，大型養殖場可以嘗試

蟹將

vanadis 發表于 2016-4-8 14:09
自己擴培益生菌的技術門檻并不是太高，就是就點麻煩，其次 是生產上和使用時間對不上號。像一些常規益生菌完 ...

的確是這樣 如果能現培現用 那是極好的

horsegreenhill

jinlimin1 發表于 2016-4-8 09:15
請教400倍顯微鏡怎么看乳酸菌、芽孢桿菌等微生物？

需要通過結晶紫染色即可觀察，可查看下面回復，有相關照片。

horsegreenhill

蟹將 發表于 2016-4-8 10:03
的確是博士級別的 但是這個培養配方不適合養殖戶，而且自己培養EM菌 pH 可以低到3.2-3.5，菌數量級達到十億 ...

您剛才也提到了，現在的EM以乳酸菌為主，這樣擴培出來的乳酸菌倒是也不錯！

horsegreenhill

蟹將 發表于 2016-4-8 10:03
的確是博士級別的 但是這個培養配方不適合養殖戶，而且自己培養EM菌 pH 可以低到3.2-3.5，菌數量級達到十億 ...

您剛才也提到了，現在的EM以乳酸菌為主，這樣擴培出來的乳酸菌倒是也不錯！

horsegreenhill

vanadis 發表于 2016-4-8 14:09
自己擴培益生菌的技術門檻并不是太高，就是就點麻煩，其次 是生產上和使用時間對不上號。像一些常規益生菌完 ...

沒錯，推薦自己擴培，經濟、節約成本，這是最大的好處。而且擴培的活菌效果還能更好一些。多多交流！

蟹將

vanadis 發表于 2016-4-8 14:09
自己擴培益生菌的技術門檻并不是太高，就是就點麻煩，其次 是生產上和使用時間對不上號。像一些常規益生菌完 ...

的確是這樣 如果能現培現用 那是極好的

漁歌子

@東興展豐盧善明：1、如果菌種在擴培中都長不成優勢，都無法抑制有害菌，只能說明該公司的菌種不行。2、擴培的菌好不好取決于菌種，國家標準生產上允許雜菌的存在。

horsegreenhill

蟹將 發表于 2016-4-8 14:20
的確是這樣 如果能現培現用 那是極好的

在養殖塘口弄個簡易發酵罐，怎么樣？現用現取

horsegreenhill

漁歌子 發表于 2016-4-8 14:31
@東興展豐盧善明：1、如果菌種在擴培中都長不成優勢，都無法抑制有害菌，只能說明該公司的菌種不行。2、擴培 ...

沒錯，希望良心公司生產良心菌種，讓老百姓都能擴培出優質、高效的益生菌！
菌種只是一方面，另外，培養基好不好？擴培方式對不對？擴培條件合適不合適？都非常重要。