免費發(fā)布：急性肝胰腺壞死病檢測方法

cuiluosheng

附件內(nèi)的《急性肝胰腺壞死病檢測方法公告》為泰國Mahidol大學(xué)Tim Flegel教授與臺灣成功大學(xué)羅竹芳教授最新發(fā)布的檢測方法公告，在閱讀他們公告的過程中深為二位專家以及他們團(tuán)隊的行業(yè)責(zé)任感所折服，為此，學(xué)習(xí)完報告之后，遂盡自己的微薄之力將之翻譯好，供行業(yè)相關(guān)人員參考、交流、學(xué)習(xí)！


AHPND細(xì)菌PCR檢測方法公告.pdf (654.78 KB, 下載次數(shù): 32)

2013-12-30 12:54 上傳

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胡路怡

好文章好文章，崔兄辛苦了哈

一醉千年

崔兄速度夠快！我上午看著新聞了，英文不夠好，勉勉強(qiáng)強(qiáng)翻譯了兩段。你這全文翻譯了，辛苦辛苦！

my_chb

{:soso_e179:}

daoming4

非常感謝能夠?qū)⑶把匦畔⒓皶r傳遞給大家，只是感覺翻譯的有點生硬。

raymin

支持支持支持支持支持

zjxenter

謝謝分享呀  以后用到再下載 呵呵

cuiluosheng

daoming4 發(fā)表于 2013-12-26 14:01
非常感謝能夠?qū)⑶把匦畔⒓皶r傳遞給大家，只是感覺翻譯的有點生硬。

水平有限，有些英語長句讀著讀著就暈了！

kanhai

小崔開始走國際路線了

cuiluosheng

此文為臺灣成功大學(xué)發(fā)布的新聞稿，其中關(guān)于檢測結(jié)果的部分翻譯更加準(zhǔn)確，請各位大俠參考這份為準(zhǔn)！
自2009年開始，亞洲蝦類養(yǎng)殖開始爆發(fā)一種未知的新興疾病，漁民發(fā)現(xiàn)在放苗后的30天內(nèi)，蝦苗會出現(xiàn)大量死亡，因此得名為偷死癥或早死癥 (early mortality syndrome, EMS)。病蝦的肝胰腺會變白及萎縮，且此器官變得難以用手指搓碎；在組織切片檢驗下，肝胰腺細(xì)胞呈現(xiàn)壞死及脫落至肝胰腺小管外，亦有大量的血細(xì)胞侵入肝胰腺，造成嚴(yán)重的發(fā)炎反應(yīng)。也因為本疾病會造成蝦類肝胰腺功能嚴(yán)重受損，因此EMS的正式疾病名則稱之為急性肝胰腺壞死綜合癥 (Acute Hepatopancreas Necrosis Disease，AHPND)。直至今日，此疾病已在中國大陸、越南、馬來西亞和泰國等重要蝦類養(yǎng)殖大國爆發(fā)，平均一年因AHPNS所造成的損失超過十億美元。
        由于AHPND已漸擴(kuò)展并威脅著全球蝦類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，科學(xué)家、養(yǎng)殖企業(yè)及第一線養(yǎng)殖業(yè)者共同齊心尋找其致病原因。在2013年5月時，位于University of Arizona，隸屬于世界動物衛(wèi)生組織參考實驗室(OIE reference lab)主持人Prof. Donald V. Lightner首度鑒定出Vibrio parahaemolyticus (VP)乃AHPND的致病原，此研究對于養(yǎng)蝦產(chǎn)業(yè)解決AHPND威脅跨出了重要的第一步。然而，對于蝦類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)而言，他們亟需檢測平臺以協(xié)助檢測種蝦、蝦苗、生物餌料…等等是否帶有此VP變異株，藉以阻斷病原體在蝦場中的侵入與散布，得以降低AHPND爆發(fā)的可能性。由于致病性VP檢測平臺于蝦類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)生物安全管理上的必須性及絕對重要性，大家對此都引頸期盼并迫切需要，一旦有高專一性、高靈敏性的檢測平臺建立，將是解決全球AHPND爆發(fā)的關(guān)鍵技術(shù)。
        本校生物科學(xué)與科技學(xué)院院長羅竹芳院長帶領(lǐng)其研究團(tuán)隊，與泰國Mahidol University的Professor T.W. Flegel進(jìn)行跨國合作，于今年(2013年)12月，領(lǐng)先全球公布了「先導(dǎo)型AHPND關(guān)鍵檢測技術(shù)平臺」，可以短時間內(nèi)檢測出致病性VP的存在，并以公開信息的方式，免費提供給全球養(yǎng)蝦產(chǎn)業(yè)使用。在此公開、免費使用的操作模式下，省去準(zhǔn)備專利申請文件、證照、商用檢測試劑盒上市諸如此類冗長的等待時間，藉由檢測方式幫助相關(guān)業(yè)者制定有效方針因應(yīng)AHPND爆發(fā)，立即性的阻絕AHPND的傳播路徑，并降低全球養(yǎng)蝦產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失。此外，這個關(guān)鍵檢測技術(shù)平臺的建立，除了是成功的跨國合作案外，藉由國立成功大學(xué)、統(tǒng)一企業(yè)總公司、臺灣行政院國家科學(xué)委員會以及國立臺灣大學(xué)的緊密互動下，成為產(chǎn)學(xué)合作、解決產(chǎn)業(yè)困境的典范案例。
        利用了次世代定序及系統(tǒng)生物學(xué)方式，羅院長及其團(tuán)隊利用全基因體解序策略，發(fā)現(xiàn)具有致病性的VP帶有特殊、獨立于染色體DNA之外的大型質(zhì)體DNA，目前也推測致病的細(xì)菌毒素基因也應(yīng)位于此質(zhì)體DNA上。因此羅院長利用質(zhì)體的特殊序列做為偵測目標(biāo)序列，設(shè)計出AP1及AP2等兩對引子對，以PCR技術(shù)做為檢測方式，希望能在更深入的研發(fā)過程之前，先以此發(fā)展為「先導(dǎo)型AHPND關(guān)鍵檢測PCR技術(shù)平臺」。若生物體存在有致病性VP，理論上可同時被AP1及AP2偵測到陽性反應(yīng)。雖然此檢測平臺的效用還需要大規(guī)模的樣本測試，但由于情況緊急，羅院長及泰國團(tuán)隊決定先行公開這項初步但重要的信息，得以減緩養(yǎng)蝦產(chǎn)業(yè)因AHPND所造成急遽攀升的經(jīng)濟(jì)損失。
        由于此為「先導(dǎo)型檢測PCR技術(shù)平臺」，基于研究責(zé)任道義，羅院長團(tuán)隊及泰國團(tuán)隊對此提出數(shù)項聲明與前驅(qū)檢測成果闡釋，使此技術(shù)平臺更加透明化:
1. 在更大規(guī)模的生物樣材測試前，我們不能保證此PCR檢測方式不會對所有非AHPND致病菌及相關(guān)生物有反應(yīng)。我們也不能保證此方法能夠偵測出所有造成AHPND的細(xì)菌。但我們誠摯邀請所有相關(guān)業(yè)者協(xié)助驗證這項新的檢測方法。
2. 在測試的68個生物樣本中，有67個樣本利用此兩對引子對(AP1及AP2)得到相同的陽性或陰性結(jié)果。然而有1個樣本利用AP1得到陽性結(jié)果，用AP2則得到陰性結(jié)果。
3. 在聯(lián)合國世界糧農(nóng)組織(FAO) 于越南地區(qū)的研究中，收集的14個樣本中，有5個組織病理切片判斷為陰性結(jié)果的樣本，利用此法檢測也同為陰性結(jié)果。然而，在8個組織病理切片被判斷為AHPND陽性的生物樣本，利用此PCR檢測平臺檢測后，有5個同樣為陽性結(jié)果，但有3個為陰性結(jié)果。
4. 在68個被推論可造成AHPND的測試細(xì)菌樣本中，利用此PCR方法檢測都呈現(xiàn)陽性結(jié)果。而于2002年的池塘采集樣本中，有3株細(xì)菌已被確認(rèn)它們不會造成AHPND也不會造成蝦只死亡，利用此PCR方法檢測后得到陰性結(jié)果。
5. 測試過程中發(fā)現(xiàn)有一菌株，蝦體致病后的組織病理切片顯示，雖非AHPND，但實際卻造成蝦只嚴(yán)重死亡及不正常肝胰腺病理切片，利用此PCR方法亦是得到陽性結(jié)果。
6. 利用此方法檢測Shewanella, Rhodococcus, Leifsonia, Delftia, Ralstonia, V. vulnificus, V. harveyi, V. alginolyticus以及 B. subtilis都得到陰性結(jié)果。

        羅院長表示，希望「先導(dǎo)型AHPND關(guān)鍵檢測PCR技術(shù)平臺」能夠加快對于AHPND傳染機(jī)制的了解進(jìn)而達(dá)到最終的疾病控制。此外，羅院長團(tuán)隊也非常歡迎任何單位使用此方法后所能提供心得及任何寶貴建議。


「先導(dǎo)型AHPND關(guān)鍵檢測PCR技術(shù)平臺」于AHPND致病菌檢測操作步驟

除了下述的實驗流程之外，用戶也可利用下述序列進(jìn)行較短的PCR產(chǎn)物反應(yīng)或巢式PCR法的檢測設(shè)計。然而這些經(jīng)改良的方法會產(chǎn)生許多偽陽性的結(jié)果，因此這些改良的方法比較不建議使用。利用AP1及AP2兩對引子對，各自能產(chǎn)生約700 bp的PCR產(chǎn)物。詳細(xì)實驗流程如下。
1. 利用一般DNA萃取方法，萃取感染蝦只的胃、肝胰腺或分離的菌株DNA。
2. 于25 μl PCR反應(yīng)體積中，加入10-100 ng范圍之間的上述DNA萃取物。
3. 兩對引子對(AHPND primer set 1 [AP1]及AHPND primer set 2 [AP2])主要使用在放大AHPND bacterial DNA片段。以下為正股及反股的引子序列:
AP1F: 5’- CCT TGG GTG TGC TTA GAG GAT G -3’
AP1R: 5’- GCA AAC TAT CGC GCA GAA CAC C -3
AP2F: 5’- TCA CCC GAA TGC TCG CTT GTG G -3’
AP2R: 5’- CGT CGC TAC TGT CTA GCT GAA G -3’
4. PCR反應(yīng)的條件為: [94°C 5分]-[(94°C 30秒、60°C 30秒、72°C 60秒) 此三步驟重復(fù)25~30次]-[最終的72°C 10分]。隨后PCR產(chǎn)物將進(jìn)行瓊脂膠體電泳之后，經(jīng)由溴化乙錠染色然后照射紫外線后可看到PCR產(chǎn)物。AHPND陽性的樣本，可看到約700 bp的產(chǎn)物，然而AHPND陰性的樣本則看不到PCR產(chǎn)物。如果需要陽性對照組的話，可以連絡(luò)羅院長研究團(tuán)隊，其可寄送含有目標(biāo)片段的質(zhì)體DNA，可以經(jīng)由大腸桿菌系統(tǒng)放大及保存，可供永久使用。


PCR Protocol
Pre-heat: 94°C, 5min
PCR 25~30 cycles with:
Denaturation: 94°C, 30 sec
Annealing: 60°C, 30 sec
Extension: 72°C, 60 sec
Final extension: 72°C, 10 min
Amplicon: ~700 bp

PCR Primers and Target Sequences
AHPND Primer Set 1 (AP1)
AHPND Primer set 1 Forward (AP1F) –
5’- CCTTGGGTGTGCTTAGAGGATG -3’
AHPND Primer set 1 Reverse (AP1R) –
5’- GCAAACTATCGCGCAGAACACC -3’
AP1 Amplicon- 700 bp
AP1 Target Sequence
CCTTGGGTGTGCTTAGAGGATGATGAAGATGACTATGTCCTCGAACGATTTGAGTTGCGAGT
TCACGGTCGTAAACCACTCGTTCTCAATCGCCCCTCGTTTTCCAAACTCATGTTCGTCACCC
AGCAGTATCTCCACACGTCACAGGAAACCACCAAGCGAATATTAAGAGCCACCATCTTAGAA
AGTGCTGAGCCCTTCACGGCGGATGAACACTGCCGATTGGTCTCTGCACTCGAAAGGCACTT
AGCTGACGTCCATGAATGAAAAAACCCGATAACATCATCATGTTATCGGGCTATTTGGTGTC
ATCAGTGTGTTTGTGTTTGGCGGTTTTACAACCATTCTTCAGCACATTCATGTGTTATCGCA
TCAGTGGTTTCAGTGATCGTGGCAGACTGAAACCCGCCGACGATGGGATTTAACGCTAAATT
CGCTACTCTCTTCGCCTCATCAAAGCAAGGAAGCACTGCAACGTACTCCTTACCCCAACTCA
CTTCAAGCGTAACTCGGCAAGCACCTTTATACCCAACCGAAACATGAACTTCTGCATCAAGC
CGGTGTTCATCGCCGTTCAATAATGAATTCATCAGCGCGCCCTCGTTAAAGAGCATTAGAAG
TGATGCACTGGAATGTTAAACCAACACACCAATGCATCGTAGAACGCCGAAATAACAGGGTG
TTCTGCGCGATAGTTTGC

AHPND Primer set 2 (AP2)
AHPND Primer set 2 Forward (AP2F) –
5’- TCACCCGAATGCTCGCTTGTGG -3’
AHPND Primer set 2 Reverse (AP2R) –
5’- CGTCGCTACTGTCTAGCTGAAG -3’
AP2 Amplicon- 700 bp
AP2 Target Sequence
TCACCCGAATGCTCGCTTGTGGCTCAGCGAGCATGGGGTCACGCCTCTATAAGTGCAAAAAC
TCTGGCTGTACCTACTACACCAAATACCTCAATCAAAGCTGTAAGTCTCGAGCTTGCTGCAG
TGGTGGCGTCAAATCCACCGAAAGGTGGATGGTTGCTTAATCGATTATTCAAATGCGCGTCC
AACATTTTAACGACTTGGGCGAAACGGCAAGACTTAGTGTACCCAGAGCCAAAACCTCATCG
AAAATCAGGATTGTTGCTTCCTACGTTGAAAGACCGGCGTTATCAGCTTCATATCCCCCACC
TCTGTCACGCCTGCGTGGATCGCTGAATGACTGTAAAAAATGACAATAAAGATTGATCAATC
TCAGAAACGTTTTGGGACAAAAATGGTTCAACAATATCTGCTGGGTATGTGGCTATCCAAAC
AATATTCTTGATAAAGGCTGGGAAATGGAAAATTCACTCTCCAAATACACCAAATTAGTACA
GAAATTTATACAATTACAGTAACATGAATCCGTCATACTGGCAGCAAGGAGTTCATGTGAGC
CAACAAGAAGAAAAATACCCGGCCAGCGCCATATCCTCCTGGAGCGGCTTTGTTTACCAAGG
AAAAGTCGCACTATATCACTCACTTAAGCTTATTCTCGATGATGATTTGGACTTCGAACTTC
AGCTAGACAGTAGCGACG

如需詳細(xì)信息，請點閱以下網(wǎng)址:
http://www.shrimpnews.com/FreeRe ... anFreeEMStests.html

cuiluosheng

kanhai 發(fā)表于 2013-12-26 21:07
小崔開始走國際路線了

被逼的啊，沒有辦法！

syusuke

@Dannyhuang  @拜耳劉濤  @haoye520  @海上積雨云   @蟲子的悲哀
好資料  快來圍觀哦

Dannyhuang

各位好！非常欽佩這些學(xué)者的專業(yè)知識和責(zé)任感。有幾個問題還是想和大家討論一下：1.急性肝胰腺壞死病的病原是否已經(jīng)確證為副溶血弧菌？可能稱之為“一株變異副溶血弧菌的檢測方法”較好。2.好像不是所有患肝胰腺壞死病的對蝦中都可以分離到副溶血弧菌？3.細(xì)菌PCR鑒定需要套式PCR檢測嗎？可否更簡單？4.樣本數(shù)。
以上僅供討論參考。謝謝！

煙花雨

Dannyhuang 發(fā)表于 2013-12-27 13:03
各位好！非常欽佩這些學(xué)者的專業(yè)知識和責(zé)任感。有幾個問題還是想和大家討論一下：1.急性肝胰腺壞死病的病原 ...

太高深了，表示看不懂啊！

Dannyhuang

接地氣啊！

cuiluosheng

Dannyhuang 發(fā)表于 2013-12-27 13:03
各位好！非常欽佩這些學(xué)者的專業(yè)知識和責(zé)任感。有幾個問題還是想和大家討論一下：1.急性肝胰腺壞死病的病原 ...

Danny提的問題非常好，可以跟臺灣成功大學(xué)羅竹芳教授發(fā)郵件交流你的想法！

hugo

樓主辛苦了，你們這些資料一般在哪個網(wǎng)站找到的呢？我以后也好關(guān)注最新信息

hugo

如果跑了電泳之后，還有一個測序結(jié)果就更好了，現(xiàn)在還難以確定他們的擴(kuò)增片段就是目標(biāo)片段

cuiluosheng

此為免費下載通道！

Dannyhuang

大家比對一下序列，看看是不是？