光合細菌對鯉魚非特異性免疫功能的影響

cjlittlepig

摘自《水利漁業》

摘要：實驗組光合細菌質量濃度分別為2.5、5.0、10.0 g/m3，在第1、7、14、21、28天檢測鯉魚血液白細胞吞噬活性和血清溶菌酶活性等指標。結果表明，該光合細菌制劑可以提高鯉魚白細胞的吞噬活性，增強血清溶菌酶活力。鯉魚的非特異性免疫功能隨著光合細菌制劑濃度的增加和潑灑時間的延長呈現增強趨勢。

關鍵詞：光合細菌 鯉魚 吞噬功能；溶菌酶活性

    隨著養殖規模的擴大，養殖產量的提高，水產動物疾病頻發成為嚴重威脅水產業的一個突出問題。面對這一問題，水產工作者們開始尋找有效的解決方法。20世紀50年代抗生素廣泛地應用于養殖業，70年代人們認識到其在帶來巨大效益的同時也帶來許多副作用⋯1，因此，人們開始尋找更加有效健康的藥物。近年來，維生素、中草藥、脂多糖、甲殼質、肽聚糖，微生態制劑等免疫增強劑成為魚病防治研究的新熱點。微生態制劑不僅可凈化水質，無藥物殘留，不產生抗藥性，而且可以促進魚類生長，提高其對環境的耐受力和應激力，產生非特異性免疫調節因子，提高機體免疫力[2]。我們研究光合細菌制劑對魚類免疫機能的影響，探討其作用機理，為微生態制劑作為魚類疾病防治的藥物提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗魚鯉來自湖北宜昌市養殖基地.體質健壯，無病元傷，質量(80±7.5)g，共200尾。

1.1.2 養殖條件

水泥池4個(3.0 m×3.0 m×0.5m)，每個池子放5O尾鯉，1號池為對照組。水溫20～25℃ ，溶氧5～6 mz／L，pH為6.8左右。1周換水1次(換池水的50％)。馴養2周后開始試驗。

1.1.3 飼料及投喂飼料購于武漢海大飼料有限公司，為l號鯉魚配合飼料。每天投喂2次，投餌率3％～5％，以吃飽剩少許為準。

1.1.4 金黃色葡萄球菌制備

    將金黃色葡萄球菌接種于淡水魚類瓊脂培養基斜面上，28℃下培養24-48 h。無菌生理鹽水(質量分數0.65％)洗下菌落，并稀釋成一定濃度，加入終質量分數為1％的福爾馬林，28℃滅活24 h，用無菌生理鹽水清洗3次，調整細菌密度至1×108／ml，保存于4℃冰箱中備用。

1.1.5 微生態制荊

    試驗所用光合細菌制劑(PSB)系華中農業大學生命科學技術學院實驗所培養，主要成分為沼澤紅假單胞菌，菌密度為5億～10億／g。實驗組每7d投放菌液1次，每次劑量為1.0 g／m3，實驗進行35 d。

1.1.6 溶壁微球菌購于中科院北京微生物研究所中國普通微生物菌種保藏中心。

1.2 方法

1.2.1 溶壁微球菌的配制

    將溶壁微球菌涂布于營養瓊脂上，28℃ 下培養過夜，以制備溶壁微球菌粉末，具體操作見參考文獻[3]。

1.2.2 血清及血細胞的收集

    從鯉魚尾靜脈采血，一部分直接加入Eppendorf(1.5ml尖頭離心管)中以制備血清，用于溶菌酶測定，另一部分用來(無菌肝素鈉)抗凝，供測定白細胞吞噬活性。

1.2.3 吞噬細胞吞噬功能的測定

    參考文獻[4]的方法。每次從尾靜脈取血1ml，置于含0.5ml肝素溶液(質量分數0.2％)的試管中混勻，加入約0.5 mL的金黃色葡萄球菌液，充分混勻后于25℃ 下水浴60 min。水浴期間每隔10 min搖勻1次。取上述混合液涂片，每個血樣涂5片。自然晾干后滴加甲醇固定5～7 min，蒸餾水沖洗，Gien~a染色1～1.5 h，自來水沖洗后再用蒸餾水沖洗，晾干。油鏡觀察記錄結果。吞噬活性分別以吞噬百分比(Phagocytic Percentixge，PP)和吞噬指數(Phagocyticindex，PI)表示：

    吞噬百分比(PP)=(100個吞噬細胞中參與吞噬的細胞數／100)×100％，

    吞噬指數(PI)=(吞噬細胞內的細菌總數／參與吞噬的吞噬細胞數)×100％

1.2.4 溶菌酶活力的測定

    主要依據文獻[5,6]的方法進行。用0.067 mol／L PBS(pH 6.4)將溶壁微球菌配成0.2 mg／mL的菌懸液，每個樣品取3ml菌懸液，吸取40μL血清加入到3 mL菌懸液中混勻后立刻在540nm下測定A0值。然后在28℃ 水浴中溫育30min，取出后置于4℃水浴中以終止反應，再測定A值，按公式計算溶菌酶活力u=( A0一A)／A0。

cjlittlepig

2 結果
2.1 光合細菌對鯉魚吞噬功能的影響
    光合細菌制劑處理組與對照組的鯉魚白細胞吞噬活性見表1。
    結果顯示，光合細菌制劑處理的鯉魚，吞噬細胞的吞噬活性比對照組要高，且隨著時間的增加而增強。t檢驗表明，3個試驗組白細胞的吞噬百分比和吞噬指數均明顯高于對照組(P<0.05)。
2.2 光合細菌對鯉魚血清中溶菌酶活力的影響
    測定結果見表2。
    施用光合細菌制劑后，鯉魚血清中溶菌酶的活力有明顯的提高，10.0 g／m3組的溶菌酶活力變化最大，且隨時間的延長而呈增高趨勢，第28天達到最高水平。經t檢驗，施用了光合細菌的3個實驗組鯉魚血清溶菌酶水平都明顯高于對照組(P<0.05)。1 g／m3組的效果最好，這與制劑使用說明吻合，明顯地提高了鯉魚血清溶菌酶的活力，從而增強了鯉魚非特異性免疫功能以及抵抗病原微生物感染的能力。

cjlittlepig

3 討論
    關于光合細菌對魚類血清中溶菌酶的影響，目前國內尚未有研究報道，更多的是作為水質凈化劑用于水產養殖的研究，且取得了很大的成功，研究結果在日本、東南亞和我國臺灣等地得到了普遍的應用[7] 。孫艦軍等[8]把光合細菌拌人飼料投喂中國對蝦22 d后發現，實驗蝦的溶菌酶活力比對照組提高53.4％，而我們的實驗在第28天后所得結果顯示溶菌酶活力提高超過了100％，這可能是研究的對象、藥物的施用技術以及環境條件不同所造成的。本試驗的結果表明，施藥7 d后開始產生作用，并且在第28天效果最高。從結果看，制劑的作用效果隨時間延長呈增強趨勢，這與簡紀常等[2]研究中草藥提高建鯉溶菌酶活力的結果有不符之處，關于其持續作用時間還需進一步的研究。
    關于光合細菌對魚類白細胞吞噬活性的影響，目前尚未發現報道，而其它的免疫增強劑對魚類白細胞的吞噬活性影響則有相關報道。劉云等[9]用甲殼胺添加于飼料中可提高鯽魚吞噬細胞的吞噬能力。本試驗施用光合細菌制劑后，白細胞的吞噬活性得到了明顯的提高，但是施用劑量和施用方法有待進一步研究。作為一種益生菌制劑，光合細菌制劑對水產動物的病害防治前景十分廣闊.值得在今后養殖生產中大力推廣。在微生態制劑的研究中也存在許多問題[10]，比如優良菌種的篩選，菌劑的保存技術、施用技術和劑量等，都有待深人地研究。

逆游的魚

哦、原來如此啊